提供了能够使用利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量逐个检测单个粒子并定量地观测粒子的状态或特性的扫描分子计数法的单个粒子检测技术。本发明专利技术的对样本溶液中的单个粒子进行检测的技术的特征在于，一边使显微镜的光检测区域的位置在样本溶液内移动一边从光检测区域检测包含实质固定的背景光的光来生成按时间序列的光强度数据，在时序光强度数据中将不发光的单个粒子(或在检测波长频带的发光强度低于背景光的粒子)进入到光检测区域内时会产生的光强度的下降作为表示各个单个粒子的存在的信号而逐个检测。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】提供了能够使用利用共焦显微镜或多光子显微镜的光测量逐个检测单个粒子并定量地观测粒子的状态或特性的扫描分子计数法的单个粒子检测技术。本专利技术的对样本溶液中的单个粒子进行检测的技术的特征在于，一边使显微镜的光检测区域的位置在样本溶液内移动一边从光检测区域检测包含实质固定的背景光的光来生成按时间序列的光强度数据，在时序光强度数据中将不发光的单个粒子(或在检测波长频带的发光强度低于背景光的粒子)进入到光检测区域内时会产生的光强度的下降作为表示各个单个粒子的存在的信号而逐个检测。【专利说明】利用光分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序
本专利技术涉及一种单个粒子检测技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测来自分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统测量依赖于单个粒子的存在的光强度的变化来检测单个粒子并进行各种分析的单个粒子检测装置、单个粒子检测方法以及单个粒子检测用计算机程序。
技术介绍
由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光测量技术检测单个粒子、对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的装置或方法。例如，在荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如参照专利文献 1-3、非专利文献1-3)中，利用激光共焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测量来自出入样本溶液中的微小区域(被称为显微镜的激光会聚到的焦点区域-共焦区组织)内的荧光分子或被荧光标识的分子(荧光分子等)的荧光强度，根据由测量得到的该荧光强度的自相关函数的值所确定的在微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)和滞留分子的个数的平均值，获取荧光分子等的运动速度或大小、浓度之类的信息，或检测分子的构造或大小的变化、分子的结合/离解反应或分散/聚合之类的各种现象。并且，在荧光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如专利文献5)中，生成与FCS同样地测量出的出入共焦区组织内的荧光分子等的荧光强度的直方图，使统计性的模型公式拟合该直方图的分布，由此估算荧光分子等的固有的亮度的平均值和滞留在共焦区组织内的分子的个数的平均值，根据这些信息估计分子的构造或大小的变化、结合/离解状态、分散/聚合状态等。另外，除此以外，在专利文献6、7中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。专利文献8提出了一种信号运算处理技术，其用于使用光子计数技术测量来自流通于流式细胞仪的荧光微粒子或固定在基板上的荧光微粒子的微弱光，来检测流体中或基板上的荧光微粒子的存在。另外，作为FCS的方式之一，专利文献9公开了如下一种方法(inverted FCS(iFCS)):在溶解有大量发光物质的溶液中分散的不发光的粒子进入到共焦区组织内时检测出的光强度下降的系统中，计算荧光强度的自相关函数的值，计算不发光的粒子在共焦区组织内的平移扩散时间和滞留粒子数的平均值。根据如上所述的FCS、FIDA等使用了利用共焦显微镜的光学系统和光子计数技术进行微小区域的荧光测量的技术的方法，进行测量所需要的样本与以前相比可以是极低浓度且极微量(在一次测量中使用的量至多为几十UL左右)，测量时间也大幅缩短(在一次测量中反复多次进行秒级时间的测量。)。因而，期待这些技术特别是在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查的强力工具。专利文献1:日本特开2005-098876专利文献2:日本特开2008-292371专利文献3:日本特开2009-281831专利文献4:日本专利第4023523号专利文献5:国际公开2008-080417专利文献6:日本特开2007-20565专利文献7:日本特开2008-116440专利文献8:日本特开平4-337446号公报专利文献9:国际公开2010-119098非专利文献1:金城政孝，蛋白质核酸酶Vol.44，N0.9，1431-1438页1999年非专利文献2:F.J.Meyer-Alms,突光相关谱(Fluorescence CorrelationSpectroscopy), R.Rigler 编,Springer,柏林,2000 年,204-224 页非专利文献3:加藤则子及其他4名，遗传医学，Vol.6，N0.2，271-277页非专利文献4:卡斯柯(Kask)及其他3名，美国科学学院纪要，1999年，96卷，13756-13761 页(P.Kask, K.Palo, D.Ullmann, K.Gall PNAS96, 13756-13761 (1999))
技术实现思路
专利技术要解决的问题在如上所述的FCS、FIDA等使用了共焦显微镜的光学系统和光子计数技术的分析技术中，利用荧光单分子或多分子水平的光强度的变化来观测单个粒子的运动，但在该光强度的分析中，执行时序地测量出的荧光强度数据的自相关函数的运算或对直方图拟合之类的荧光强度的波动的计算等统计性的处理，而并非逐个地参照或分析各个单个粒子的运动。即，在这些光分析技术中，对表示粒子的存在的光强度的变化统计性地进行处理，检测粒子的统计平均性的特性。因而，为了在这些分析技术中得到统计上有意义的结果，需要样本溶液中的作为观测对象的单个粒子的浓度或数密度在平衡状态下为在一次的秒级长度的测量时间内能够进行统计性的处理的个数的单个粒子出入微小区域内的水平，优选的是在微小区域内始终存在一个左右的单个粒子的水平以上。实际上，共焦区组织的体积为IfL左右，因此，在上述的光分析技术中使用的样本溶液中的单个粒子的浓度典型地是InM左右或其以上，在大幅低于InM时，产生在共焦区组织内不存在单个粒子的时间而无法得到统计上有意义的分析结果。另一方面，在专利文献6?8所记载的单个粒子的检测方法中，不包括荧光强度的波动的统计性的运算处理，即使样本溶液中的单个粒子小于InM也能够检测单个粒子等，但无法定量地计算在溶液中随机运动的单个粒子的浓度或数密度。因此，本申请的 申请人:在日本特愿2010-044714和PCT/JP2011/53481中，提出了基于新原理的光分析技术，能够定量地观测作为观测对象的发出光的粒子(发光粒子)的浓度或数密度低于利用FCS、FIDA等包含统计本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶梨拓哉，田边哲也，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：
国别省市：
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