目标粒子的检测方法技术

该目标粒子的检测方法中，(a)调制包含目标粒子、与前述目标粒子结合的发光探针和分离回收用粒子的溶液、或者包含结合有前述发光探针的前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子的溶液，在该溶液中，形成由前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子形成的复合体的工序；(b)在前述工序(a)之后，从前述溶液中通过固液分离处理回收前述分离回收用粒子，调制包含该分离回收用粒子的试样溶液的工序；(c)通过扫描分子计数法算出前述试样溶液中存在的前述复合体的分子数；前述分离回收用粒子与由前述目标粒子和前述发光探针形成的结合体结合。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】该中，(a)调制包含目标粒子、与前述目标粒子结合的发光探针和分离回收用粒子的溶液、或者包含结合有前述发光探针的前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子的溶液，在该溶液中，形成由前述目标粒子、前述发光探针和前述分离回收用粒子形成的复合体的工序；(b)在前述工序(a)之后，从前述溶液中通过固液分离处理回收前述分离回收用粒子，调制包含该分离回收用粒子的试样溶液的工序；(c)通过扫描分子计数法算出前述试样溶液中存在的前述复合体的分子数；前述分离回收用粒子与由前述目标粒子和前述发光探针形成的结合体结合。【专利说明】
本专利技术涉及使用共聚焦显微镜、多光子显微镜的光学系统等能够检测到来自溶液中的微小区域的光的光学系统求出在试样溶液中分散并随机运动、且与基于固液分离处理的分离回收用粒子结合后的粒子的浓度的方法。本申请基于2011年8月30日在日本提交的日本特愿2011-187600号主张优先权，本文援引其内容。
技术介绍
随着近年来光学测量技术的发展，使用共聚焦显微镜的光学系统和能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测定单光子或单分子荧光水平的微弱光。因此，提出了使用这样的微弱光的检测技术，进行生物分子等的分子间相互作用或者分子间的结合/解离反应的检测的各种装置或方法。提出有例如，荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy:FCS。例如，参见专利文献 I ?3、非专利文献I?3)中，使用激光共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术，测定来自在试样溶液中的微小区域(显微镜的激光聚光而成的焦点区域，被称为共焦体积。)内出入的荧光分子或进行了荧光标记的分子(荧光分子等)的荧光强度。然后基于由测定的荧光强度的自相关函数的值确定的、微小区域内的荧光分子等的平均滞留时间(平移扩散时间)以及滞留的分子个数的平均值，能够取得荧光分子等的运动速度或大小、浓度这类信息，或者检测到分子的结构或大小的变化、分子的结合/解离反应或分散/聚集的各种现象。此外，提出有利用突光强度分布分析(Fluorescence-1ntensity Distribution Analysis:FIDA。例如，专利文献4、非专利文献4)或光子计数直方图(Photon Counting Histogram:PCH。例如，专利文献5)，与FCS同样地，生成检测到的出入共焦体积内的荧光分子等的荧光强度的直方图。并且，通过对该直方图的分布拟合统计学公式而算出荧光分子等固有的明亮度的平均值和滞留于共焦体积内的分子的个数的平均值，根据这些信息，推测分子的结构或大小的变化、结合/解离状态、分散/聚集状态等。此外，专利文献6、7中提出了:基于使用共聚焦显微镜的光学系统测定出的试样溶液的荧光信号的时程来检测荧光性物质的方法。专利文献8中提出了一种信号运算处理技术，其用于:使用光子计数技术，测量在流式细胞仪内流过的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒所发出的微弱光，检测液流中或基板上的荧光微粒的存在。特别是，通过应用FCS、FIDA等、使用了共聚焦显微镜的光学系统和光子计数技术的微小区域的荧光测定技术的方法，测定所必需的试样的浓度比以前低得多且可以是微量(每次测定使用的量最多数十UL左右)，测定时间也大幅地缩短(每次测定中可重复进行数次的秒数量级时间的测定。)。因此，特别在对于医学和生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或高价的试样进行分析的情况下或者在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等被检体多的情况下，这些技术与现有的生物化学的方法相比较，可以期待能够成为低廉或迅速地进行实验或检测的强有力的工具。现有技术文献专利文献专利文献1:日本特开2005-098876号公报专利文献2:日本特开2008-292371号公报专利文献3:日本特开2009-281831号公报专利文献4:日本专利第4023523号公报专利文献5:国际公开第2008/080417号专利文献6:日本特开2007-20565号公报专利文献7:日本特开2008-116440号公报专利文献8:日本特开平4-337446号公报非专利文献非专利文献1:金城政孝、蛋白質核酸酵素、1999年、第44卷、第9号、第1431?1438 页。非专利文献2:Meyer-Alms、Fluorescence Correlation Spectroscopy>R.Rigler编、Springer、柏林、2000 年、第 204 ?224 页。非专利文献3:加藤则子等4名、遺伝子医学、2002年、第6卷、第2号、第271?277 页。非特許文献4:P.Kask、其他3名(K.Palo, D.Ullmann, K.Gall)、美国《国家科学院院刊》(PNAS)、1999年、第96卷、第13756?13761页。
技术实现思路
专利技术要解决的问题上述的FCS、FIDA、PCH等光分析技术简而言之是通过统计学处理算出所测量的荧光强度随时间波动的大小，根据该波动的大小确定在试样溶液中的微小区域内出入的荧光分子等的各种特性。因此，为了在上述的光分析技术中得到有意义的结果，作为试样溶液中的观测对象的荧光分子等的浓度或数密度适合调制成:在平衡状态下在秒数量级长度的一次测量时间中有能够统计学处理的个数的荧光分子等出入微小区域内；优选调制成在微小区域内经常地存在有一个左右的荧光分子等(典型地，共焦体积的体积为IfL左右，所以荧光分子等的浓度优选为InM左右或其以上。)。换言之，试样溶液中的观测对象粒子的浓度或数密度大幅地低于能够统计学处理的程度时(例如，大幅地低于InM时)，产生测量时间内只有稀少的观测对象物进入微小区域内的状态，在荧光强度的测量结果中长期包括着观测对象物在微小区域内完全不存在的状态，并且显著的荧光强度的观测量变少，所以通过如上述的基于荧光强度的统计学波动的光分析技术难以获得有意义的或精度良好的分析结果。专利文献6、7中所述的、使用共聚焦显微镜的光学系统的荧光性物质的检测方法中公开有:不进行如上述的涉及荧光强度波动的统计学处理，根据数秒的测量时间内有无显著强度的荧光信号的产生，判断试样中的观测对象的荧光分子等的有无，而得到显著强度的荧光信号的频率与试样中的荧光分子等的粒子数的相关性。特别是在专利文献7中，提出了产生搅拌试样溶液的随机流动时，检测灵敏度提高。然而，即便在这些方法，也只停留在检测通过扩散或随机的流动概率地进入微小区域内的荧光分子等的存在，不能把握微小区域内的荧光分子等的粒子行为，并没有实现例如:粒子的计数、定量地算出粒子的浓度或数密度。此外，专利文献8中记载的技术是逐个检测流式细胞仪的液流中的荧光微粒或固定在基板上的荧光微粒的存在的技术，而不是用于检测试样溶液中在通常的状态下溶解或分散的分子或胶体等的粒子，即不是用于对于在试样溶液中随机运动的粒子进行检测的技术，所以并没有定量地算出在试样溶液中溶解或分散的粒子的浓度或数密度。另外，专利文献8的技术包含流式细胞仪中的测量或者荧光粒子向基板上的固定化处理的过程，因此可以认为，检测所需要的试样量远大于FCS、FIDA、PCH等的光分析技术的情况，并且对实施者要求复杂的高难度的操作技术。另本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶梨拓哉，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：
国别省市：