本发明专利技术公开了一种检测稻曲菌素A的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本发明专利技术所提供的方法及其专用试剂盒所使用的抗稻曲菌素A的单克隆抗体是由小鼠杂交瘤细胞株2D3G5分泌产生的，该小鼠杂交瘤细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC?No.8774。本发明专利技术所提供的抗稻曲菌素A的单克隆抗体是以稻曲菌素A-OVA（稻曲菌素A和卵清白蛋白的偶联物）为包被抗原，通过间接竞争ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选得到的；利用该单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒，用于定性或定量检测植物样品中的稻曲菌素A，线性检测范围在2.8-72.0ng/mL，具有快速、特异性强、灵敏度高的优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种检测稻曲菌素A的方法及其专用酶联免疫试剂盒。本专利技术所提供的方法及其专用试剂盒所使用的抗稻曲菌素A的单克隆抗体是由小鼠杂交瘤细胞株2D3G5分泌产生的，该小鼠杂交瘤细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC?No.8774。本专利技术所提供的抗稻曲菌素A的单克隆抗体是以稻曲菌素A-OVA（稻曲菌素A和卵清白蛋白的偶联物）为包被抗原，通过间接竞争ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选得到的；利用该单克隆抗体制备得到的间接竞争酶联免疫试剂盒，用于定性或定量检测植物样品中的稻曲菌素A，线性检测范围在2.8-72.0ng/mL，具有快速、特异性强、灵敏度高的优点。【专利说明】检测稻曲菌素A的方法及其专用酶联免疫试剂盒
本专利技术涉及一种检测稻曲菌素A的方法及其专用酶联免疫试剂盒。
技术介绍
稻曲病(Falsesmut of rice)是由稻绿核菌(Villosiclava virens (Nakata)Tanaka&Tanaka)(无性态为:Ustilaginoidea virens (Cooke) Takahashi )侵染形成的一种世界性水稻真菌病害，也叫伪黑穗病、绿黑穗病等。自20世纪80年代以来，由于水稻品种的变化、耕作制度的改变和化学肥料的大量使用以及杂交水稻的问世等因素，稻曲病的发生及危害呈加重趋势，已成为中国及世界上多稻区的主要病害之一。稻曲病会严重影响水稻产量和品质，更为严重的是稻曲病菌能产生毒素，为害人畜，直接影响水稻的食用安全性。迄今，稻曲病菌中已阐明的毒素有两类，第一类为黑粉菌素(Ustilaginoidins)，属于二萘并- Y-卩比喃酮类(Bis(naphtho_ Y_pyrone)s),为脂溶性有色物质；另一类为稻曲菌素(Ustiloxins)，属于环肽类，为水溶性无色物质。稻曲菌素具有广泛的毒性，对水稻种子萌发、幼苗生长及愈伤组织生长都具有毒害作用；可造成畜禽生长和生殖能力的下降和内脏器官病变；对微管蛋白组装和细胞骨架形成具有抑制作用。基于稻曲菌素广泛的毒性，快速、准确了解稻曲球、稻曲病菌、以及稻草和稻谷及其制品中稻曲菌素的种类和含量就显得尤为重要。稻曲菌素A (Ustiloxin A)是主要的稻曲菌毒素成分，因此稻曲菌素的检测分析主要针对稻曲菌素A。目前可采用薄层层析(TLC)检测法、高效液相色谱(HPLC)法、液-质联用(LC-MS)法进行分析。由于免疫测定技术具有高通量、快速及灵敏度高等特点，在真菌毒素的检测方面已经获得了广泛的应用。虽然文献已有报道关于稻曲菌素A的抗血清，但只是定性地定位稻曲菌素A在稻曲病菌中的分布情况，基于稻曲菌素A的单克隆抗体的酶联免疫检测方法及其专用酶联免疫试剂盒还未见报道，所以开发一种基于稻曲菌素A的单克隆抗体的酶联免疫检测方法及其专用酶联免疫试剂盒具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测稻曲菌素A的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该方法及其专用试剂盒所使用的抗稻曲菌素A的单克隆抗体是由小鼠杂交瘤细胞株2D3G5分泌产生的，该小鼠杂交瘤细胞株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC N0.8774。上述小鼠杂交瘤细胞株2D3G5CGMCC N0.8774分泌产生的抗稻曲菌素A的单克隆抗体，也是本专利技术保护的范围。上述抗稻曲菌素A的单克隆抗体可用于检测或辅助检测稻曲菌素A，尤其适合于检测或辅助检测植物样品中的稻曲菌素A。本专利技术所提供的小鼠杂交瘤细胞株2D3G5CGMCC N0.8744或抗稻曲菌素A的单克隆抗体可用于制备检测或辅助检测稻曲菌素A的试剂或试剂盒，特别是用于制备检测或辅助检测植物样品中的稻曲菌素A的试剂或试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供一种检测或辅助检测稻曲菌素A的试剂盒。本专利技术所提供的试剂盒中含有独立包装的所述抗稻曲菌素A的单克隆抗体。 在本专利技术所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的稻曲菌素A标准品。所述抗稻曲菌素A标准品可为稻曲菌素A或由所述稻曲菌素A配制成的一系列不同浓度的稻曲菌素A溶液；所述一系列不同浓度的稻曲菌素A溶液的浓度具体可为:200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL 和 3.125ng/mL,所述稻曲菌素A溶液的溶剂具体可为水，稀释可用样品稀释液；所述样品稀释液的溶剂为水，溶质为Na2HPO4, KH2PO4和NaCl、吐温-20和明胶；所述Na2HPO4、所述KH2PO4和所述NaCl在所述样品稀释液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐温-20在所述样品稀释液中的体积百分含量为0.1% ;所述明胶在所述样品稀释液中的含量为5g/L。在本专利技术所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的标记酶；所述标记酶可为辣根过氧化酶或碱性磷酸酶。在本专利技术的一个实施例中，所述标记酶具体为羊抗鼠酶标二抗IgG-HRP (购自Jackson公司，商品目录号为79556)。在本专利技术所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的如下I)-5)试剂中的至少一种:I)包被缓冲液:溶剂为水，溶质为Na2CO3和NaHCO3 ;所述Na2CO3和所述NaHCO3在所述包被缓冲液中的浓度分别为0.0lM和0.04M ；pH9.6。2)样品稀释液:溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2POjP NaCl、吐温-20和明胶；所述Na2HPO4、所述KH2PO4和所述NaCl在所述样品稀释液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐温-20在所述样品稀释液中的体积百分含量为0.1% ;所述明胶在所述样品稀释液中的含量为5g/L ;pH7.5。3)洗涤液:溶剂为水，溶质为Na2HP04、KH2P04、NaCl和吐温-20 ;所述Na2HPO4、所述KH2PO4和所述NaCl在所述洗涤液中的浓度分别为0.02M、0.0015M和0.14M ;所述吐温-20在所述洗涤液中的体积百分含量为0.1% ；pH7.5。4)底物缓冲液:溶剂为水，溶质为柠檬酸三钠和Na2HPO4 ;所述柠檬酸三钠和所述Na2HPO4在所述底物缓冲液中的浓度分别为0.0lM和0.03M ；pH5.5。5 )终止液:2M的硫酸水溶液。在本专利技术所提供的试剂盒中，还可含有独立包装的包被原。所述包被原为稻曲菌素A与载体蛋白的偶联物。在所述包被原中，所述稻曲菌素A与所述载体蛋白的质量配比可为1.15:7.50。在本专利技术中，所述载体蛋白具体为卵白蛋白(0VA)，将相应的包被原命名为稻曲菌素A-OVA包被原。具体的，所述稻曲菌素A-OVA包被原是按照如下步骤的方法制备得到的:(al)将稻曲菌素A溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液A ；所述稻曲菌素A和所述二甲基甲酰胺(DMF)的比例为2.3mg:l.0mL ；(a2)将卵白蛋白(OVA)溶解于PBS溶液中，得到溶液B ;所述卵白蛋白(OVA)和所述PBS溶液的配比为7.5mg:l.0mL ；(a3)将所述溶液A和所述溶液B混合，使混合液中所述稻曲菌素A和所述卵白蛋白(OVA)的质量配比为1.15:7.50，得到溶液C ;(a4)向所述溶液C中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王保民，周立刚，傅小香，单体江，王晓晗，赖道万，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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