本发明专利技术涉及一种邻苯二甲酸（2-乙基己）酯的间接竞争酶联免疫法检测方法，间接竞争酶联免疫法属于光度酶联免疫分析，利用抗原抗体的特异性反应，可以高效快速地检测环境激素邻苯二甲酸（2-乙基己）酯。首先要合成易与蛋白质结合的4-氨基邻苯二甲酸（2-乙基己）酯，再将蛋白质结合上去，制得免疫原，再将免疫原注射到大白兔体内得到抗体。然后建立起间接竞争酶联免疫法检测邻苯二甲酸（2-乙基己）酯。邻苯二甲酸（2-乙基己）酯是危害生物体健康的环境激素，间接竞争酶联免疫法建立，可以高效快速地检测河水，湖泊，食品，化妆品等物品中邻苯二甲酸（2-乙基己）酯的含量。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种，间接竞争酶联免疫法属于光度酶联免疫分析，利用抗原抗体的特异性反应，可以高效快速地检测环境激素邻苯二甲酸（2-乙基己）酯。首先要合成易与蛋白质结合的4-氨基邻苯二甲酸（2-乙基己）酯，再将蛋白质结合上去，制得免疫原，再将免疫原注射到大白兔体内得到抗体。然后建立起间接竞争酶联免疫法检测邻苯二甲酸（2-乙基己）酯。邻苯二甲酸（2-乙基己）酯是危害生物体健康的环境激素，间接竞争酶联免疫法建立，可以高效快速地检测河水，湖泊，食品，化妆品等物品中邻苯二甲酸（2-乙基己）酯的含量。【专利说明】邻苯二甲酸(2-乙基己)酯的间接竞争酶联免疫法检测方法
本专利技术涉及一种邻苯二甲酸(2-乙基己)酯的间接竞争酶联免疫法检测方法。
技术介绍
邻苯二甲酸酯类物质主要用于聚氯乙烯材料，令聚氯乙烯由硬塑胶变为有弹性的塑胶，起到增塑剂的作用。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品等数百种产品中。由于邻苯二甲酸酯作为可增塑剂被添加到塑料生产过程中时并不与塑料分子发生结合，这类物质可以从塑料制品中渗出，人类在使用塑料产品的过程中可通过皮肤接触、吸入、直接摄取此类物质，从而对人体的健康造成极大的危害。邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，可干扰内分泌，使男子精液量和精子数量减少，精子运动能力低下，精子形态异常，严重的会导致睾丸癌，是造成男子生殖问题的“罪魁祸首”。在化妆品中，指甲油的邻苯二甲酸酯含量最高，很多化妆品的芳香成分也含有该物质。化妆品中的这种物质会通过女性的呼吸系统和皮肤进入体内，如果过多使用，会增加女性患乳腺癌的几率，还会危害到她们未来生育的男婴的生殖系统。邻苯二甲酸(2-乙基己)酯(DEHP)是最广泛使用的增塑剂，除了乙酸纤维素、聚乙酸乙烯外，与绝大多数工业上使用的合成树脂和橡胶均有良好的相容性。塑化剂DEHP作用类似人工荷尔蒙，体内长期累积高剂量，可能会造成小孩性别错乱，包括生殖器变短小、性征不明显，目前虽无法证实对人类是否致癌，但对动物会产生致癌反应。所以对邻苯二甲酸酯类的检测显得十分重要。目前邻苯二甲酸酯类的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法、固相微萃取法等，其中最常采用的是气相和高效液相色谱法。这些方法测定污染物灵敏度较高，精确度好，但是这类分析方法体系中将待测污染物从样品中分离提取并去除杂质干扰的处理过程十分复杂，操作费时繁琐，仪器和分析成本昂贵。所以开发一种简单、快速、适用于现场监控的痕量分析方法具有重要的现实意义。免疫分析技术是基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段，一种以抗体作为生物化学检测器，对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量的分析技术。间接酶联免疫反应是利用抗原抗体的特异性反应实现的，首先制得免疫原，再将此免疫原注射到兔子体内，制得高特异性抗体，利用间接竞争酶联免疫法将标准品与待测样竞争与抗体的反应，酶标二抗体的酶可以促使底物液发光，测得吸光度值，即可建立标准曲线求得待测样浓度。间接竞争酶联免疫法属于光度酶联免疫分析，利用抗原抗体的特异性反应，可以高效快速地检测环境激素邻苯二甲酸(2-乙基己)酯。间接竞争酶联免疫法是酶联免疫吸附分析技术的一种。酶联接免疫吸附剂测定(ELISA)已广泛应用于临床医学、动物检疫、药物残留等分析领域。目前酶联接免疫吸附剂测定邻苯二甲酸酯类已有一些报导，但对邻苯二甲酸(2-乙基己)酯的酶联分析还尚未报导过。测定邻苯二甲酸(2-乙基己)酯主要有相色谱法、高效液相色谱法等，此类方法从样品中分离提取并去除杂质干扰的处理过程十分复杂，操作费时繁琐。所以在此我们探寻能够快速简便地检测邻苯二甲酸(2-乙基己)酯的间接竞争酶联免疫法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种邻苯二甲酸(2-乙基己)酯的间接竞争酶联免疫法检测方法，解决邻苯二甲酸(2-乙基己)酯属于半抗原，不能直接作用生物体使其产生抗体的问题。首先要合成易与蛋白质结合的4-氨基邻苯二甲酸(2-乙基己)酯，再将蛋白质结合上去，制得免疫原，再将免疫原注射到大白兔体内得到抗体。然后建立起间接竞争酶联免疫法检测邻苯二甲酸(2-乙基己)酯。具体技术方案如下:一种邻苯二甲酸(2-乙基己)酯的间接竞争酶联免疫法检测方法，包括如下步骤:(I)合成易与蛋白质结合的4-氨基邻苯二甲酸(2-乙基己)酯；(2)将蛋白质结合上去，制得免疫原；(3)将免疫原注射到实验动物体内得到抗体；(4)建立起间接竞争酶联免疫法检测邻苯二甲酸(2-乙基己)酯。进一步地，步骤(4)中进一步包括如下步骤:(4-1)包被:将包被抗原DEHAP-0VA稀释一定倍数包被96孔酶标板，温育并洗涤；(4-2)封闭:加入OVA溶液，封闭没有包被抗原的多余的部分，温育并洗涤；(4-3)竞争:每孔加入邻苯二甲酸(2-乙基己)酯标准溶液或样品溶液和邻苯二甲酸(2-乙基己)酯抗体，使之发生竞争反应，温育并洗涤；(4-4)加酶:每孔加入HRP标记的羊抗兔IgG，温育并洗涤；(4-5)检测:加入底物液显色，温育后，加入终止液终止反应，在多功能酶标仪上测定吸光值。进一步地，步骤(4-1)中，将包被抗原DEHAP-0VA稀释一定倍数包被96孔酶标板，每孔100 μ L，放置培养箱37°C温育2h后，取出用洗涤液PBST洗涤3次，每次3min ;和/或，步骤(4-2)中加入1%0VA溶液，每孔150 μ L，封闭没有包被抗原的多余的部分，避免抗体的非特异吸附在酶标板上，37°C温育30min后，取出同上洗涤3次；和/ 或，步骤(4-3)中每孔加入50 μ L邻苯二甲酸(2-乙基己)酯标准溶液或样品溶液和50 μ L邻苯二甲酸(2-乙基己)酯抗体，使之发生竞争反应，37°C下温育2.5h后，同上洗涤；和/ 或，步骤(4-4)中每孔加入IOOyL HRP标记的羊抗兔IgG，37°C下温育2h后取出同上洗涤3次；和/或，步骤(4-5)中加入底物液显色,每孔100 μ L,温育30min后,加入终止液终止反应，在多功能酶标仪上测定吸光值。 进一步地，步骤(I)中首先由4-硝基邻苯二甲酸合成4-硝基邻苯二甲酸(2-乙基己)酯，再还原得到半抗原4-氨基邻苯二甲酸(2-乙基己)酯。进一步地，步骤(2)中将BSA偶联上去制得免疫抗原，将免疫抗原注射到动物体内。进一步地，步骤(3)中动物经过一定时间生长反应获得抗体。进一步地,步骤(4 )中通过抗原、抗体及酶标二抗之间的特异反应建立起测定邻苯二甲酸(2-乙基己)酯的方法。进一步地，所述饱和硫酸铵溶液的配制采用如下步骤:取500mL蒸馏水，加热至70?80°C，将400g硫酸铵粉剂溶于水中，搅拌20min，硫酸铵结晶沉于瓶底，上清即为饱和硫酸铵，室温冷却后用脱脂棉过滤，再取28%氨水将饱和硫酸铵调节至pH7.0 ;和/或生理盐水的配制采用如下步骤:0.85gNaCl加蒸馏水至IOOmL ；和/ 或0.01mol/LpH7.2 磷酸缓冲液(PB)的配制采用如下步骤:0.2mol/LNa2HP0436.0mL,0.2moI/LNaH2PO414.0mL 混合，蒸馏水定容到 IOOOmL ；和/ 或包被缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张明翠，钟君亚，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：
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