薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析方法技术

本发明专利技术提供一种薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析方法，是将薄皮甜瓜中果肉总蛋白质提取后，首先进行等电聚焦电泳，再进行SDS-PAGE凝胶垂直电泳。本发明专利技术提供了一种经济、简便、易行、快速的适用于薄皮甜瓜中果肉的总蛋白的提取及双向电泳方法。本发明专利技术使用Tris/酚提取-甲醇乙酸铵沉淀法提取蛋白质，可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白质，减少大量糖分和其他有机质的影响。目前，经反复实验证明：实验样品制备全、2-DE电泳操作简单、且图谱清晰、重复性好、试剂毒性较低、结果可靠，可为葫芦科园艺作物蛋白质组学研究提供技术范例，是一套适用于薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析的双向电泳技术。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种，是将薄皮甜瓜中果肉总蛋白质提取后，首先进行等电聚焦电泳，再进行SDS-PAGE凝胶垂直电泳。本专利技术提供了一种经济、简便、易行、快速的适用于薄皮甜瓜中果肉的总蛋白的提取及双向电泳方法。本专利技术使用Tris/酚提取-甲醇乙酸铵沉淀法提取蛋白质，可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白质，减少大量糖分和其他有机质的影响。目前，经反复实验证明：实验样品制备全、2-DE电泳操作简单、且图谱清晰、重复性好、试剂毒性较低、结果可靠，可为葫芦科园艺作物蛋白质组学研究提供技术范例，是一套适用于薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析的双向电泳技术。【专利说明】
本专利技术属于园艺作物蛋白质组分析领域，尤其涉及一种。
技术介绍
甜瓜((Szcwffii1S L)果实香甜，富含糖、淀粉,还有少量蛋白质、矿物质及其他维生素，作为一个优质高产的园艺作物，近年来越来越受到青睐。然而，目前关于甜瓜生长发育进程中蛋白质组的变化、不同生境下的差异蛋白质组以及外源物质调节的蛋白质组变化鲜见报道。特别是果实中蛋白质的含量和各种酶对果实发育过程中不同生理生化反应的作用，逆境条件下果实中蛋白质种类、功能及代谢的途径，以及蛋白质磷酸化的作用机制等等方面的研究缺乏。这些都与实际生产存在密切关系，因此，研究甜瓜果实中的蛋白质组，并结合代谢组的研究探索果实发育模式及制定相应调控措施，将为创造高产、具有良好农艺特征的甜瓜提供美好的前景。
技术实现思路
本专利技术提供了一种，应用本专利技术的方法可以从薄皮甜瓜中果肉提取出较高纯度的蛋白质，得到清晰、重复性好的图谱，并且经过数据的分析能得出较多差异蛋白点，便于质谱分析。本专利技术提供的一种，是将薄皮甜瓜中果肉总蛋白质提取后，首先进行等电聚焦电泳，再进行SDS-PAGE凝胶垂直电泳。优选地，所述薄皮甜瓜蛋白质提取是将薄皮甜瓜中果肉用Tris提取液/Tris-饱和酚提取，用含乙酸铵的甲醇溶液沉淀得到的。此方法可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白质，避免大量糖分和其他有机质的影响。进一步地，每Ig薄皮甜瓜中果肉需要3?4 ml Tris提取液和3?4 ml Tris-饱和酚。在此比例下可以最大量的溶解出样品中的蛋白质，减少样品和试剂的浪费。是提取甜瓜中果肉总蛋白的最优比例。所述Tris提取液和Tris-饱和酚的体积比为1:1。优选地，所述等电聚焦电泳中使用24cm胶条。选择24cm胶条，是为了使蛋白质更好的分离，避免蛋白质点之间的重叠，使蛋白质点在胶上达到最大程度的分离。进一步地，所述等电聚焦电泳中上样量为800 μ g蛋白质，终上样体积为450 μ I。此上样量是24cm胶条的最优上样量，这样蛋白点聚焦好，无横纹和竖纹，分离彻底，能够得到清晰的蛋白质图谱。优选地，所述等电聚焦电泳后包括胶条平衡的步骤，所述胶条平衡分两步，每步20mino每步平衡20min，可以保证每步的平衡完全彻底，又不会造成过度平衡。优选地，在所述SDS-PAGE凝胶垂直电泳中，先IW /块跑Ih，琼脂糖形成一条直线后,调成5W/块跑8h。前Ih以内选择IW/块胶的功率跑胶，可以使蛋白质在低功率下均匀平稳的从胶条上转移到胶上，然后选择较高的功率跑胶，使不同的蛋白质达到快速高效的分离。优选地，所述SDS-PAGE凝胶垂直电泳后包括固定、染色、脱色的步骤，在固定后用纯水清洗，所述染色时间为24小时。本专利技术提供了一种经济、简便、易行、快速的适用于薄皮甜瓜中果肉的总蛋白的提取及双向电泳方法。本专利技术使用Tris/酚提取-甲醇乙酸铵沉淀法提取蛋白质，可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白质，减少大量糖分和其他有机质的影响。目前，经反复实验证明:实验样品制备全、2-DE电泳操作简单、且图谱清晰、重复性好、试剂毒性较低、结果可靠，可为葫芦科园艺作物蛋白质组学研究提供技术范例，是一套适用于薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析的双向电泳技术。【专利附图】【附图说明】图1为上样量为500 μ g蛋白质，使用不同pH范围的胶条进行等电聚焦电泳，再进行凝胶垂直电泳后的图谱比较；其中，图1A使用的是pH3-10，24cm胶条；图1B使用的是pH4-7, 24cm 胶条； 图2为使用pH4-7，24cm胶条时，不同蛋白质上样量进行等电聚焦电泳，再进行凝胶垂直电泳后的图谱比较；其中，图2A的上样量为SOOyg蛋白质；图2B的上样量为800 μ g蛋白质。【具体实施方式】以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。如未特殊说明，“％”为质量百分比。薄皮甜瓜虽然包括许多品种，但是品种间果实中糖类、胶质、酚类等物质的成分和含量相差不多，因此本专利技术的方法适用于薄皮甜瓜的所有品种。本专利技术采用Tris提取液/Tris饱和酹提取-甲醇乙酸铵沉淀法提取蛋白质。蛋白质裂解、定量。计算上样量后进行第一向等电聚焦，一般需要30h。第一向完成，进行胶条平衡。然后开始第二向SDS-PAGE凝胶垂直电泳。最后把凝胶固定、染色及脱色，得到蛋白点清晰的图谱。实施例1 本专利技术的薄皮甜瓜蛋白质组分析方法具体如下: 1、蛋白质的提取 称取薄皮甜瓜(京蜜11号)中果肉约lg，置液氮中研磨成粉状后，向研钵中加入3mlTris 提取液(Tris 提取液配方:50 mmol /T,Tri s, 50 mmol/L EDTA, 100 mmol/L 氯化钾，2%DTT，30%蔗糖，lmmol/L PMSF,其余为水)，待其融化后，继续研磨3?4min，转至离心管中，加入等体积pH8.0 Tris-饱和酹,润镟,离心(10000 Xg,4°C) IOmin0取酹层，以等体积Tris提取液加入酚层中抽提2次，往酚层中加入约5倍体积0.1 mo I/L乙酸铵的甲醇溶液，-20°C沉淀2h以上。离心(15000 Xg，4°C)20min，弃上清液，沉淀用-20°C预冷甲醇洗涤I次，再以丙酮(含2%DTT，-20°C预冷)洗涤2次，室温干燥，所得干粉置_80°C保存待用。样品的裂解 向样品的蛋白质粉末中加入250μ I裂解液(7Μ尿素，2Μ硫脲，4% CHAPS, 2%IPG-buffer,50 mMDTT)进行裂解。30KHz超声波促溶20min后，在室温下静置2h，使蛋白质充分溶解。转至小离心管中，离心(20000Xg) 20min,进一步促溶。2、蛋白质定量 用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)进行定量。3、等电聚焦 本专利技术所用为PH4-7的24cm胶条，上样量为800 μ g蛋白质，样品液+水化液(7M尿素，2M硫脲，2% CHAPS,0.5 % IPG buffer, 65 mM DTT)终上样体积为450 μ I。等电聚焦的程序如表1所示: 表1【权利要求】1.一种，其特征在于:是将薄皮甜瓜中果肉总蛋白质提取后，首先进行等电聚焦电泳，再进行SDS-PAGE凝胶垂直电泳。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述薄皮甜瓜蛋白质提取是将薄皮甜瓜中果肉用Tris提取液/Tris-饱和酚提取，用含乙酸铵的甲醇溶液沉淀得到的。3.根据权利要求2所述的方法，其特本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郝敬虹，黄雅芳，房克凤，杨瑞，刘超杰，韩莹琰，杨柳，王建立，张卿，宋婷婷，孙中华，于同泉，王绍辉，范双喜，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：