本发明专利技术涉及一种检测羟基自由基的比率型荧光探针及合成方法和用途，该比率型荧光探针是将蛋白质包裹具有荧光的BSA-AuNCs（金纳米簇）和对羟基自由基有特定响应的有机分子HPF（2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoicacid）共价键和在一起，从而形成比率型荧光探针。此探针无羟基自由基的条件下仅BSA-AuNCs会发射出参比荧光，当环境中存在羟基自由基时，探针上的HPF会与羟基自由基发生反应，生成荧光产物，发射出羟基自由基的响应荧光。由于参比荧光的存在，可以有效的降低由于激光光源稳定性，激光强度，探针浓度，光学对焦，细胞内环境变化等原因引起的测定误差，能够更准确的测定羟基自由基的浓度。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种，该比率型荧光探针是将蛋白质包裹具有荧光的BSA-AuNCs（金纳米簇）和对羟基自由基有特定响应的有机分子HPF（2-benzoicacid）共价键和在一起，从而形成比率型荧光探针。此探针无羟基自由基的条件下仅BSA-AuNCs会发射出参比荧光，当环境中存在羟基自由基时，探针上的HPF会与羟基自由基发生反应，生成荧光产物，发射出羟基自由基的响应荧光。由于参比荧光的存在，可以有效的降低由于激光光源稳定性，激光强度，探针浓度，光学对焦，细胞内环境变化等原因引起的测定误差，能够更准确的测定羟基自由基的浓度。【专利说明】
本专利技术属于生物检测技术及临床医学检测领域，具体涉及一种。
技术介绍
活性氧是生物体生命代谢不可避免的副产物，它在机体的先天性免疫、信号转导、细胞的增生、分化、凋亡等方面有重要的作用，但是同时，活性氧自由基对生物机体也存在着氧化损伤，使组织细胞的结构发生破坏性修饰，损伤正常组织细胞的形态和功能(文献1:Chen X.，.Probing oxidative stress: Small molecule fluorescent sensors ofmetal ions, reactive oxygen species, and thiols，Coord.Chem.Rev.,2011,40:4783-4804)。 羟基自由基是目前已知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的一种自由基，它能够造成细胞中DNA、脂质、糖类、蛋白质等分子过度氧化，而造成细胞伤害。相关研究证据显示，这些损伤可进一步造成多种退化性疾病、老化、突变以及癌症的形成(Tang，B.，Probing Hydroxyl Radicals and Their Imaging in Living Cells by Use of FAM -DNA-Au Nanoparticles, Chem.Eur.J.,2008, 14，522-528)，因此，对羟基自由基的测定尤为重要。羟基自由基的寿命短，含量低，对其的检测是化学分析和生命科学分析领域最困难的问题之一。目前，国内外文献报道的检测羟基自由基的方法主要有电子自旋共振法(Yim，Μ.B.，Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radicalproduction from hydrogen peroxide, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，1990，87，5006-5010)，电化学法(Li，L，An Electrochemical Strategy for Fast Monitoring of?OH Released from Live Cells at Electroactive FcHT-Functional Surface Amplifiedby Au Nanoparticles, Chem.Commun.，2013，49，1279-1281 )，以及焚光法(Czili，Η.，Applicability of coumarin for detecting and measuring hydroxyl radicalsgenerated by photoexcitation of TiO2 nanoparticles, App1.Catal.B.，2008，81，295-302)等。荧光分析法具有灵敏度高、选择性好、重现性高、线性范围宽、方法简便快速等优点，且与激光共聚焦显微技术结合后，可以实现活体细胞和组织内目标物的“实时、定量、可见”的检测。目前已报道用于检测细胞内羟基自由基的探针多为单发射型，不能有效避免测定环境所引起的误差。比率型荧光探针测定时包含两个荧光信号峰，其中一个作为参比荧光型号，另一个作为对待测物有响应的响应荧光信号，根据两个荧光信号的光强度比值度待测物进行定量，由于参比荧光的存在，在测定的过程中可以有效的避免复杂环境变化所引起的误差(A.Zhu.Carbon-Dot-Based Dual-Emission Nanohybrid Produces a RatiometricFluorescent Sensor for In Vivo Imaging of Cellular Copper 1ns， Angew.Chem.1nt.Ed.,2012,51: 7185—7189)。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种对细胞渗透性好，毒副作用小，适用于生物体内羟基自由基检测的比率型荧光探针。本专利技术的目的之二是提供一种工艺简单的该荧光探针的合成方法。本专利技术的目的之三是提供该荧光探针的用途。本专利技术提出的一种检测羟基自由基的比率型荧光探针，以牛血清蛋白为还原剂和保护剂，制备具有荧光的BSA-AuNCs (金纳米簇)中，使牛血清蛋白上的胺基和对羟基自由基有特定响应的有机分子 HPF(2-benzoicacid)的羧基反应，产生共价键，从而形成比率型荧光探针。本专利技术提出的一种检测羟基自由基的比率型荧光探针的合成方法，具体步骤如下: (1)在37°C和充分磁力搅拌的条件下，将5体积，浓度为10 mM的氯金酸水溶液加入到5体积、质量浓度为50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5体积浓度为I M的NaOH溶液，持续反应12 h ;用透析膜(MWC0: 3500)将反应得到的产物在超纯水中透析24h,得到BSA-AuNCs溶液； (2)室温条件下，将体积为10μ L浓度为5 mM的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，加入催化剂0.0400 g 1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和0.0400 g N-羟基琥珀酰亚胺活化，再加入步骤(I)得到的AuNCs溶液反应10 h ;所得产物在pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中透析，得到比率型荧光探针溶液。本专利技术提出的比率型荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的荧光成像检测，以及临床医学上组织和器官中羟基自由基的检测。本专利技术提出的比率型荧光探针对羟基自由基的识别是基于有机分子HPF对羟基自由基的特殊响应。在没有羟基自由基的情况下，比率型荧光探针中只BSA-AuNCs会发射出荧光；当有羟基自由基存在时，羟基自由基会切断HPF中的对苯酚基，生成荧光素类荧光物质，成为双发射比率型荧光探针。本专利技术提出的比率型荧光探针通常加入含有细胞及组织的适当缓冲溶液中进行测试，其线性范围为0μΜ-150μΜ。本专利技术提出的比率型荧光探针结合激光共聚焦显微技术被实际应用于Hela细胞在氧化应激条件下的羟基自由基的细胞成像。本专利技术的荧光探针有如下优点: (I)作为比率型荧光探针，由于参比荧光的存在，可以有效的降低由于激光光源稳定性，激光强度，探针浓度，光学对焦，细胞内环境变化等原因引起的测定误差，能够更准确的测定羟基自由基的浓度。(2)合成方法简单，在室温下即可，不需要严格的合成条件； (3)对羟基自由基有良好的选择性，其它活性氧物质几乎不会产生干扰荧光信号。(4)参比荧光的存在可以有效避免由测定环境的变化而引起的误差。(5)探针的细胞毒性低，本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：庄梅，田阳，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：
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