穿梭载体是具有两种不同的复制起点和筛选标记、能够在大肠杆菌和另一种宿主细胞中独立存在并进行复制的质粒载体。目前广泛使用的穿梭载体都含有用作筛选标记的抗药基因，其生物安全性是限制微生物转基因技术推广应用的关键因素。本发明专利技术成功利用葡萄糖胺合成酶基因取代抗药基因，获得酵母-大肠杆菌，穿梭载体pGFA。新载体的特征：(1)不含潜在危害性基因，具有生物安全性；(2)筛选功能强，能够有效维持重组表征；(3)不受微环境中富营养条件的影响；(4)两种宿主共用筛选标记，从而精简了载体分子、扩大了载体容量、提高了基因转化率。通过pGFA赋予新功能的酵母细胞可以在食品发酵、饲料添加、环境修复等领域得到推广应用。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】穿梭载体是具有两种不同的复制起点和筛选标记、能够在大肠杆菌和另一种宿主细胞中独立存在并进行复制的质粒载体。目前广泛使用的穿梭载体都含有用作筛选标记的抗药基因，其生物安全性是限制微生物转基因技术推广应用的关键因素。本专利技术成功利用葡萄糖胺合成酶基因取代抗药基因，获得酵母-大肠杆菌，穿梭载体pGFA。新载体的特征：(1)不含潜在危害性基因，具有生物安全性；(2)筛选功能强，能够有效维持重组表征；(3)不受微环境中富营养条件的影响；(4)两种宿主共用筛选标记，从而精简了载体分子、扩大了载体容量、提高了基因转化率。通过pGFA赋予新功能的酵母细胞可以在食品发酵、饲料添加、环境修复等领域得到推广应用。【专利说明】无抗药基因的酵母-细菌穿梭载体的构建和应用
本专利技术涉及生物工程领域；具体涉及分子生物技术、基因工程、细胞工程、环境修复等
；更具体涉及I种不含抗药基因的酵母-细菌穿梭载体及其应用技术。
技术介绍
穿梭载体是具有两种不同的复制起点和筛选标记、能够在大肠杆菌和另一种宿主细胞中独立存在并进行复制的质粒载体(吴乃虎，2001，《基因工程原理》，p.502)。大肠杆菌是转化率最高、质粒最容易分离的宿主细胞。为了有效转化大肠杆菌以外的宿主细胞，人们首先需要在大肠杆菌中进行基因克隆和载体构建，并通过大肠杆菌细胞制备较大量的纯质粒；因此，所采用的质粒必须含有一套大肠杆菌的复制元件和筛选标记，同时含有第二套适用于另一种宿主细胞的复制元件和筛选标记。筛选标记是质粒载体所必备的基本元件。抗药基因是微生物转基因的有效筛选标记，目前所使用的在不同微生物和大肠杆菌之间共用的穿梭载体都含有用作筛选标记的抗药基因。通过这些载体转基因可能导致抗药基因的扩散，其生物安全性问题长久以来一直是限制微生物转基因技术推广应用的关键因素。营养缺陷型筛选标记可以避免抗药基因的传播，具有生物安全性，但是自然环境或自然培养基中富含氨基酸、核苷酸等营养成分，使相关的营养缺陷型筛选标记不能够维持筛选压力。同时，由于细菌易于回复突变，营养缺陷型筛选标记在细菌如大肠杆菌中未能有效运用。谷氨酰胺:6_磷酸果糖氨基转移酶(Gfa)又称6_磷酸葡萄糖胺合成酶(Glm);它是一种胞内酶，催化底物谷氨酰胺和6-磷酸果糖形成6-磷酸葡萄糖胺和谷氨酸，即氨基己糖合成代谢途径中的第一步反应(Bearne SL, J Biol Chem, 1996, 271:ρ.3052-7)。Gfa 几乎存在于每个物种和组织中，是生命`活动所必需的(Yamazaki K，et al.，Gene, 2000, 261:p.329-36 ；Smith RJ, et al., J Bacteriol，1996，178:ρ.2320-7)。Gfa 编码基因的失活会使细胞依赖于外源葡萄糖胺的补充。本实验室在以前的研究中，我们首次用实验证明葡萄糖胺合成酶基因可以是一种既适用于真菌又适用于细菌的生物安全性的筛选标记基因(Wu G，et al., PLoS One,2011.6:p.el7082)。我们敲除了大肠杆菌(Escherichia coli)的Gfa编码基因glmS和粟裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)的Gfa编码基因gfal,构建了两种gfa缺失菌株，E.coli Δ glmS和S.pombe Δ gfal ;这些菌株在不添加葡萄糖胺的培养基中不能正常生长。当我们用带有glmS基因的大肠杆菌质粒pHsh-glmS转化大肠杆菌后,含有质粒的大肠杆菌细胞得到成功筛选。同样，用带有gfal的粟酒裂殖酵母质粒pREP-AGCX转化菌株S.pombeAgfal能够使它重新获得在不添加葡萄糖胺的培养基上生长的能力；其中，pREP-AGCX和其他所有的穿梭载体一样:至少带有I个用作大肠杆菌筛选标记的抗药，如amf (氨苄青霉素抗药基因)(Wu G, et al.，PLoS One, 2011,6:p.el7082)。
技术实现思路
1.专利技术目的:以Gfa缺失菌株为基础，创建I个既能够被酵母系统又能够被大肠杆菌系统识别和转录表达的非抗药性筛选标记，从而构成I个不带有任何抗药基因的穿梭载体。本专利技术的穿梭载体由生物安全性基因构成，从而能够在基因重组菌株的应用范围方面取得突破:用该质粒进行遗传改造的细胞可以直接应用于食品发酵、饲料添加、环境修复等复杂环境。2.技术关键:将粟酒裂殖酵母基因gfal (Sp-gfa)用着酵母-大肠杆菌穿梭载体中的筛选标记，对Sp-gfa上游的转录表达元件进行重新设计和改造,使穿梭载体中的Sp-gfa在大肠杆菌和粟酒裂殖酵母都具有筛选标记功能，不再使用抗生素筛选，达到构建生物安全性穿梭载体的目的。3.技术方案:(1)利用生物信息学软件分析粟酒裂殖酵母gfal基因的启动子和终止信号序列区，并将含有自身启动子和终止信号序列的gfal基因插入到一个原核载体PHsh中。(2)在pHsh-Sp-gfa中，删除gfa基因中的内含子序列，并人工改造gfa基因的终止密码子下游序列，形成可以在大肠杆菌中使用的终止子序列。(3)在优化过的pHsh-Sp-gfa载体基础上，人工设计改造gfa基因的启动子序列，加入大肠杆菌的σ 70启动子核心序列和核糖体结合位点SD序列，并转化Ε.coli Δ glmS。(4)将经过改造的可在大肠杆菌中发挥筛选功能的gfa基因序列插入到pREP3X中，并删除载体中的Ieu和amp筛选标记基因序列,构建成新型穿梭载体pGFA(图1)。(5)验证改造后的穿梭载体在gfa缺失型菌株S.pombe Δ gfal和E.coli Δ glmS中的转化和选择功能。(6)新型穿梭载体pGFA克隆外源基因在裂殖酵母中进行表达试验。4.本专利技术可取得的有益效果:(I)本专利技术产生的质粒pGFA是一个生物安全性的转基因载体。这是生物工程领域第I个成功剔除抗生素筛选标记基因的新型穿梭载体，质粒的基本元件仅包含质粒复制元件和gfa筛选标记，前者广泛存在于自然界而后者是各种生物都具有的必需基因。(2) pGFA所使用的非抗药基因筛选标记能够有效地维持筛选压力，从而有效防止重组基因的丢失。(3) pGFA的筛选作用不依赖于抗菌素或其他化学品的添加，也不受自然环境或发酵原料中的糖、氨基酸、核苷酸等营养成分的影响。(4)在pGFA中，不同宿主共用同一个筛选标记，质粒的分子得到充分精简，外源目标基因的容量进一步扩大，基因转化率得到提闻。【专利附图】【附图说明】图1.本专利技术的穿梭载体pGFA(B)与通用穿梭载体㈧的结构图比较。图2.筛选标记gfa基因的起始密码子上游序列人工设计改造前后比较。图3.载体 pGFA 转化 E.coli Δ glmS(A,B)和 S.pombe Δ gfal 的互补验证(C,D):在不补充葡萄糖胺的培养基上，只有带有PGFA的菌株才能生长(B，D)。图4.运用载体pGFA克隆木聚糖酶基因，使无抗药基因酵母重组菌分泌木聚糖酶。【具体实施方式】:本专利技术中所用术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面的方法结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本专利技术。应理解实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何方式限制本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：邵蔚蓝，王洪成，
申请(专利权)人：仙奕生物科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。