产生O‑乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生O‑乙酰高丝氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了能够以高产量产生L‑蛋氨酸前体O‑乙酰高丝氨酸的微生物株和利用所述微生物株产生O‑乙酰高丝氨酸的方法。所述微生物株是埃希氏菌属的菌株，其中，向所述菌株中引入并表达了乙酰‑CoA合酶基因(acs)和/或编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)。

【技术实现步骤摘要】
产生O-乙酰高丝氨酸的微生物和利用所述微生物产生O-乙酰高丝氨酸的方法
本专利技术涉及能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸(L-蛋氨酸前体)的微生物株。另外，本专利技术还涉及利用所述微生物株高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的方法。
技术介绍
可以通过化学或生物学方式合成在动物饲料、食品和医药中使用的蛋氨酸。在化学合成中，蛋氨酸基本上是通过水解5-(β-甲基巯基乙基)乙内酰脲产生的。然而，合成的蛋氨酸的不利之处在于以L-型和D-型的混合物的形式存在，这需要困难的额外方法将它们彼此分开。为了解决该问题，本专利技术的专利技术人开发了用于选择性地合成L-蛋氨酸的生物学方法，L-蛋氨酸是已有专利申请(WO2008/103432)要求保护的化学物质。该方法(简称为“两步法”)包括发酵产生L-蛋氨酸前体和由L-蛋氨酸前体向L-蛋氨酸的酶促转化。所述蛋氨酸前体优选包括O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸。就对常规方法存在的问题的克服对所述两步法进行评价，所述常规方法存在的问题例如硫化物的毒性、蛋氨酸和SAMe在蛋氨酸合成中的反馈调控，以及胱硫醚γ-合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶对中间产物的降解。另外，与产生DL-蛋氨酸的常规化学合成法相比，所述两步法具有以下优点：仅对L-蛋氨酸具有选择性，并且伴随产生作为有用副产物的有机酸，例如琥珀酸和乙酸。作为蛋氨酸生物合成途径中的中间产物，O-乙酰-高丝氨酸被用作产生蛋氨酸前体(WO2008/013432)。如下式所示，在O-乙酰转移酶的协助下由L-高丝氨酸和乙酰-CoA合成O-乙酰-高丝氨酸：L-高丝氨酸+乙酰-CoA→O-乙酰-高丝氨酸。在本申请的受让人的美国专利公开第US2009-0253186A1号中公开了其中引入了thrA和metX基因以分别提高L-高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸的生物合成的微生物株，以及利用所述微生物株高产量地产生O-乙酰高丝氨酸的方法。关于这一点，本专利技术的专利技术人认为增加乙酰-CoA(O-乙酰高丝氨酸的生物合成中使用的两种底物之一)可提高O-乙酰高丝氨酸的产量。在大肠杆菌中，大部分乙酰-CoA是由丙酮酸合成的。然而，如果存在过量的葡萄糖，可以由培养基中累积的乙酸产生乙酰-CoA。从乙酸合成乙酰-CoA可以利用两种不同的生物合成途径。在一种乙酰-CoA生物合成途径中，存在乙酰腺苷酸(AcAMP)中间产物，而乙酰-CoA合酶(acetyl-CoAsynthase，ACS)通过该中间产物将乙酸活化成乙酰-CoA。在另一种途径中，作为由乙酸激酶(ACK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化的连续反应的结果，通过乙酰磷酸将乙酸转化为乙酰-CoA(JOURNALOFBACTERIOLOGY,May1995,p.2878-2886)。在由乙酰-CoA合酶介导的生物合成途径中发挥重要作用的乙酰-CoA合酶对乙酸具有高亲和力，其甚至可以将细胞内或细胞外的低水平乙酸活化成为乙酰-CoA。相比而言，ACK-PTA-介导的乙酰-CoA生物合成途径仅在可能由混合酸的发酵形成的高乙酸水平下进行，因为ACK和PTA酶对乙酸具有低的亲和力(J.Gen.Microbiol.102:327-336)。对于乙酰-CoA合酶，由于位于启动子上游的CRP-结合位点，其表达在指数生长前在转录水平上受到代谢物阻遏控制的抑制，而此后当细胞进入静止期时，其表达增高(MolMicrobiol.2004Jan;51(1):241-54.)。因此，可以通过ACK-PTA途径将在发酵中期累积的乙酸活化成乙酰-CoA。然而，由于ACK-PTA途径是可逆的，如果乙酸的水平低，那么乙酰-CoA被转化为乙酸。也就是说，在ACK-PTA途径中可能发生乙酰-CoA的消耗，显示出对O-乙酰高丝氨酸合成的负作用。在乙酰-CoA的合成中与乙酸一起作为底物使用的辅酶A(CoA)是细胞内的代表性酰基基团载体。辅酶A由泛酸经过一系列的步骤合成，每个步骤的酶促催化如下所示。首先，泛酸激酶(CoaA)将泛酸(维生素B5)活化成4'-磷酸泛酸，然后向4'-磷酸泛酸上加入半胱氨酸形成4'-磷酸泛酰-L-半胱氨酸(4’-phosphopantothenoyl-L-cysteine)，然后利用P-PanCys合酶/P-PanCys脱羧酶(coaBC)的组合通过脱羧作用形成4'-磷酸泛酰巯基乙胺。然后，通过磷酸泛酰巯基乙胺(P-PanSH)腺苷酰基转移酶(coaD)将4'-磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰化，从而形成脱磷酸-CoA。最后，利用ATP通过脱磷酸辅酶A(deP-CoA)激酶(coaE)将脱磷酸-CoA磷酸化为辅酶A。通常，CoA是细胞内多数代谢反应以及很多合成反应的辅助因子。为此，通过调节机制将CoA库保持在恒定水平。调节细胞内CoA库的首要关键因子是泛酸激酶，其催化第一关键步骤并且是CoA生物合成中的限速酶。通过反馈抑制调节泛酸激酶是控制细胞内CoA浓度的主要因素(JBiolChem.1994Oct28;269(43):27051-8)。然而，细胞内保持的恒定CoA水平可能是通过乙酰-CoA有效产生O-乙酰高丝氨酸的障碍。据报道，用丙氨酸A取代第106位的精氨酸R使泛酸激酶由对CoA的反馈抑制敏感转变为对反馈抑制具有抗性(JournalOfBacteriology,185,June2003,p.3410-3415)。发现在存在40mMCoA时，野生型蛋白仅保留约20%的催化活性，而在相同浓度的CoA下却没有检测到R106A突变蛋白的催化活性降低。另外，发现，与野生型相比，表达突变蛋白的突变株具有显著高的细胞内CoA水平。为完成本专利技术，本专利技术的专利技术人进行了广泛而深入的研究，发现引入并增强(a)对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶基因，和(b)O-乙酰CoA合酶基因中的任一个或两个都导致O-乙酰高丝氨酸产量显著提高，如图1所示。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是提供能够以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的微生物株，所述微生物株经过设计通过过表达acs基因和对CoA的反馈抑制具有抗性的coaA基因而增强乙酰-CoA的生物合成途径。本专利技术的另一个目的是提供利用所述微生物株以高产量产生O-乙酰高丝氨酸的方法。根据本专利技术的一个方面，提供能够产生O-乙酰高丝氨酸的埃希氏菌属的菌株，其中，向所述菌株中引入并增强了：(a)乙酰-CoA合酶基因(acs)；(b)编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA)；或(c)(a)的乙酰-CoA合酶基因(acs)和(b)的泛酸激酶基因(coaA)两者。根据本专利技术的另一方面，提供在培养基中产生O-乙酰高丝氨酸的方法，所述方法包括在培养基中发酵所述株。根据本专利技术的再一方面，提供产生L-蛋氨酸和乙酸的方法，所述方法包括：(a)发酵埃希氏菌属的菌株从而产生O-乙酰高丝氨酸；(b)分离O-乙酰高丝氨酸；和(c)在选自由胱硫醚γ-合酶、O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶组成的组的酶存在下，将O-乙酰高丝氨酸和甲基硫醇一起转化为L-蛋氨酸和乙酸(acetate)。因此，根据本专利技术可以通过生物学方式高产量地产生O-乙酰高丝氨酸，这种方法的环境友好度高于化学方法。此外，可以酶促地，例如通过O-乙本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2009.08.28 US 12/550,0991.一种具有提高的O-乙酰高丝氨酸生产力的埃希氏菌属的菌株，其中在所述菌株中引入并增强了：编码对CoA的反馈抑制具有抗性的泛酸激酶的泛酸激酶基因(coaA),所述埃希氏菌属的菌株通过修饰引入了编码高丝氨酸乙酰转移酶的基因并增强了高丝氨酸乙酰转移酶活性。2.如权利要求1所述的埃希氏菌属的菌株，其中通过利用新的启动子或突变的启动子或者通过增加所述基因的拷贝数来引入并增强所述每一个基因。3.如权利要求2所述的埃希氏菌属的菌株，其中所述新的启动子选自由pTrc、pPro、pR和pL组成的组。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：金素影，申容旭，许仁庚，金贤雅，徐昌一，金朱恩，孙晟光，李相穆，全成后，李汉珍，罗光镐，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：