本发明专利技术公开了氨基化硅胶协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法。该方法将酱油渣提取物经MPLC纯化，洗脱；将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水放置，分离上相与下相；以上相作为固定相，下相为流动相，制得分离样品溶液；在无水乙醇‐蒸馏水中加入正硅酸酯，调节pH值，反应，加入γ‐氨丙基三乙氧基硅烷，静置陈化，制得γ‐氨丙基硅胶微球；将上相作为固定相，下相为流动相泵入高速逆流色谱仪，注入加有γ‐氨丙基硅胶微球的上相与下相的混合液，进行高速逆流色谱分离，得大豆异黄酮。本发明专利技术利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附的协同作用，改善强极性天然产物的分离效果，有效解决高速逆流色谱中强极性物质分离的难题。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了氨基化硅胶协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法。该方法将酱油渣提取物经MPLC纯化，洗脱；将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水放置，分离上相与下相；以上相作为固定相，下相为流动相，制得分离样品溶液；在无水乙醇‐蒸馏水中加入正硅酸酯，调节pH值，反应，加入γ‐氨丙基三乙氧基硅烷，静置陈化，制得γ‐氨丙基硅胶微球；将上相作为固定相，下相为流动相泵入高速逆流色谱仪，注入加有γ‐氨丙基硅胶微球的上相与下相的混合液，进行高速逆流色谱分离，得大豆异黄酮。本专利技术利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附的协同作用，改善强极性天然产物的分离效果，有效解决高速逆流色谱中强极性物质分离的难题。【专利说明】氨基化硅胶协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法
本专利技术涉及大豆异黄酮，特别是涉及一种氨基化硅胶协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，属于农副产品深加工及食品工业
。
技术介绍
酱油渣是酱油生产的副产品，生产过程有大量酱油渣生成。目前对其开发利用有限，主要用作饲料或肥料的配料，附加值低，对其有效成分的提取分离及高值化利用是酱油渣开发利用的一个重要方向。因此，提取分离出有药用价值的大豆异黄酮，对酱油渣循环利用的研究将具有重要的意义。即使在制取酱油后的豆渣仍含有丰富的大豆异黄酮成分，大豆异黄酮是大豆中的一种天然植物雌激素，具有多种生物学作用，与人体健康密切相关，除具有抗肿瘤作用外，还对衰老、心血管疾病、骨质疏松症及更年期综合症具有预防和治疗作用。因此，为了利用酱油渣资源，提取分离出有药用价值的大豆异黄酮，对酱油渣循环利用的研究将具有重要的意义。中压色谱(MPLC)相对于常压色谱来说，分离效率更高；比高压制备色谱来的经济，仪器要求配置低；使用预装柱，可以提高效率。主要用于大量的复杂有机混合物、组合化学、新药开发或天然产物研究过程中的分离和纯化，具有速度快、省溶剂、分离量大和重复性好等特点。高速逆流色谱(HSCCC)是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液-液分配色谱分离技术。其原理是螺旋管分离柱在做行星式运动时产生的变化离心力场将一部分固定相永久的保留在螺旋管中，使两相溶剂在分离柱中呈单向性分布，形成单相流体动力平衡体系。流动相与固定相反复接触，溶质被两相多次萃取、分配，最终按照分配系数的不同，实现分离。其不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适用于天然生物活性成分的分离。 现时对大豆异黄酮进行提取，主要是以加热回流提取为主，但加热回流提取对热不稳定成分不适用，温度过高导致部分黄酮类化合物分解；在放大到工业生产时超声提取效果较差。高速逆流色谱技术在分离一些简单体系和中、低极性样品体系方面存在其它分离技术无可超越的优势，但对于强极性的物质分离效果却受到溶剂体系的制约。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术存在的问题，提供一种氨基化硅胶协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法。本专利技术利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附分离的协同作用，来改善逆流色谱的分离效果，提高分离效率。本专利技术在高效逆流色谱分离天然产物的过程中加入Y -氨丙基硅胶微球，利用HSCCC溶剂系统和硅胶微球的协同作用，来改善天然产物的分离效果。本专利技术通过把强极性的氨基键合到硅胶微球的表面，可解决强极性物质的分离问题，而亲水作用色谱可满足这种分离的需要；本专利技术将逆流色谱柱中引入Y -氨丙基硅胶微球，利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附的协同作用，来改善强极性天然产物的分离效果；本专利技术在不改变逆流色谱仪器的基础上，借鉴高效液相色谱的研究思路，将逆流色谱液液分配原理与Y -氨丙基硅胶微球的吸附分离功能有机的结合起来，在逆流色谱柱中填入Y -氨丙基硅胶微球并对其进行改性，引入功能化基团，利用逆流色谱的液液分配及其硅胶微球改性基团吸附分离的协同作用，来改善逆流色谱的分离效果，提高分离效率。本专利技术为了实现上述目的，采用如下技术方案:一种氨基化硅胶协同HSCCC提取酱油渣中大豆异黄酮的方法，包括以下步骤:(1)粗提物的制备:将酱油渣提取物经MPLC纯化，以乙醇-蒸馏水为洗脱液，流速为15 - 25ml/min进行梯度洗脱，然后将溶剂减压浓缩，得到大豆异黄酮粗提物，置冰箱保存；(2)样品溶液的制备:将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水加入到分液漏斗中，充分震荡后放置12 - 24小时，将上相与下相分离；按体积份数计，正己烷为100份，乙酸乙酯为150 - 200份，甲醇为150 - 250份，水为150 - 200份；以上相作为固定相，下相为流动相；将100体积份上相与80 -130份下相混合，每毫升上相与下相的混合物中溶解大豆异黄酮粗提物3 - 15毫克，制得分离样品溶液；(3) Y -氨丙基硅胶微球的制备:按体积份数计，在100 -120份无水乙醇-蒸馏水中加入13- 15份正硅酸酯，调节pH值到7-9，反应0.5- 1.0h后，再加入2 - 3份Y -氨丙基三乙氧基硅烷，静置陈化24 - 48h，制得Y -氨丙基硅胶微球；无水乙醇与蒸馏水的体积比为3:5 - 3:7 ；(4)高速逆流分离:将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪，将高速逆流色谱仪的多层胶管柱充满；当高速逆流色谱仪稳定运行时，将下相为流动相，将流动相泵入到多层胶管前端；当有15 - 25ml的固定相被推出的时候,注入1- 3ml加有、-氨丙基硅胶微球的上相与下相的混合液，且每毫升上相与下相的混合物中加入Y -氨丙基硅胶微球100 -300毫克；当有流动相从多层胶管尾端流出时，将5 - 15ml样品溶液从进样口注入，再补充注入10 - 20ml固定相，进行高速逆流色谱分离，得大豆异黄酮。为进一步实现本专利技术目的，优选地，所述梯度洗脱是在前15min内，以纯水进行洗脱；15 - 30min内，洗脱液为20%乙醇-80%水；30 - 45min内，洗脱液为40%乙醇-60%水；45 - 60min内，洗脱液为60%乙醇-40%水；60 - 75min内，以80%乙醇-20%水进行洗脱；75 -90min内，以95%乙醇-5%水进行洗脱；然后将溶剂减压浓缩，得到大豆异黄酮粗提物，置冰箱保存；所述将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪是以8.5 - 10.5ml/min的流速将上相作为固定相泵入高速逆流色谱仪。所述将流动相泵入到多层胶管前端是将流动相以1.2 - 1.8ml/min的流速泵入到多层胶管前端。所述稳定运行的速度优选为600 - 800rpm。用紫外检测器在254nm波长持续检测高速逆流色谱分离的流出物，得到酱油渣提取物的HSCCC色谱图，根据谱图中不同峰的出峰时间，收集每个峰的流出物，得大豆异黄酮。与已有技术相比，本专利技术具有如下有益效果:(1)本专利技术不用任何固态载体的液、液色谱技术，分离效率高，产品纯度高。(2)本专利技术不存在载体对样品的吸附和污染，制备量大和溶剂消耗少。(3)本专利技术显著提高了酱油渣的附加值，有利于酱油渣的综合开发利用。(4)本专利技术也适用于其他中高极性天然产物的提取，对极性样品的吸附作用更显著。【专利附图】【附图说明】图1A、1B、1C、1D为对比实施例和实施例1中Y -氨丙基硅胶微球加入量分别为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梁勇，吴继明，杨明泉，陈穗，刘占，孙丽霞，樊瑞，
申请(专利权)人：广东美味鲜调味食品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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