一株猪传染性胃肠炎病毒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株猪传染性胃肠炎病毒弱毒株HB08株及其应用。本发明专利技术弱毒株的微生物保藏号是：CGMCC?No.7807。本发明专利技术TGEV弱毒株安全性好，该毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪均安全。本发明专利技术弱毒株对3日龄仔猪的主动保护率达100%，被动保护率达97.2%，表明本发明专利技术对于猪传染性胃肠炎具有良好的免疫保护效果。

【技术实现步骤摘要】
一株猪传染性胃肠炎病毒及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株猪传染性胃肠炎病毒及其应用。
技术介绍
猪传染性胃肠炎（porcinetransmissiblegastroenteritis,TGE）是引起猪腹泻的一种重要接触性病毒性肠道传染病，发病快，对2周龄以内仔猪有高度致死率，几乎能达到100%。5周龄以上的猪病死率较低，但是由于腹泻的影响，生长慢，饲料报酬低，造成严重的经济损失。该病1946年由Doyle等人确定了病原。从60年代末起，我国许多省市有该病流行。该病自流行以来，国内外专家做了很多工作，目前，还没有特效的制剂抵抗猪传染性胃肠炎病毒，临床上多采用对症疗法以减轻症状和降低死亡率。国内外有使用疫苗的报道，接种途径不一，效果也不是很满意。尤其近几年，猪腹泻病对养猪业已经造成了巨大的经济损失。除了进一步加强饲养管理外，研制出一种能够有效防制猪传染性胃肠炎的疫苗迫在眉睫。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一株猪传染性胃肠炎病毒及其应用。该弱毒株遗传稳定、安全性好，用其制备的疫苗对于猪传染性胃肠炎具有良好的保护效力。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：从河北省某猪场送检猪传染性胃肠炎阳性的病料中分离到TGEV。将分离到的猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞上连续传代120代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在ST细胞上传代至165代。将第165代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为886bp。从第125代开始ORF3基因连同前面的间隔区序列出现81个核苷酸的缺失（起始密码子前30个核苷酸、后51个核苷酸连续81个核苷酸缺失），第125代、145代、165代稳定缺失81个核苷酸。致弱性试验结果表明，从第125代开始，TGEV对仔猪失去致病性；将TGEV145代种毒在猪体连传5代，毒力依然很稳定，没有任何返强现象。经鉴定，分离到的病毒株为猪传染性胃肠炎病毒新病毒株，将125~165代致弱毒株种毒命名为猪传染性胃肠炎病毒HB08株，并于2013年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为：CGMCCNo.7807。本专利技术还提供含有所述毒株的猪传染性胃肠炎病毒活疫苗。在本专利技术一个实施方案中，所述的活疫苗中，猪传染性胃肠炎病毒弱毒株HB08株的含量为≥105.0TCID50/ml。本专利技术还提供所述毒株在制备治疗猪传染性胃肠炎病毒感染药物中的应用。本专利技术弱毒株的安全性好，安全试验结果表明，该毒株对妊娠母猪、仔猪等各年龄猪均安全。本专利技术对3日龄仔猪的主动保护率达100%，被动保护率达97.2%，而对照组的发病率达100%，表明本专利技术对于猪传染性胃肠炎具有良好的免疫保护效果，该效果已高于国内TGEV华毒弱毒株的免疫效果。附图说明图1TGEVCPE图片（400×）。图2TGEV分离毒S基因PCR检测结果。图中，M：DNAmarkerDL2000；1：样品；2：阴性对照。图3不同代次TGEVORF3序列比对。图4TGEV分离毒ORF3基因PCR扩结果。图中，M：DNAmarkerDL2000；1：样品；2：阴性对照。图5TGEV猪体传代前与猪体连传五代后ORF3序列比对。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定一、猪传染性胃肠炎病毒的分离河北某猪场送检腹泻猪小肠，取其内容物，用RT-PCR方法进行检测，结果为猪传染性胃肠炎阳性。取送检小肠适量，刮取肠粘膜和内容物，按照1:5的比例（重量:体积）加入PBS，反复冻融3次，离心取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液中加入终浓度为20μg/ml的胰酶，37℃处理1.5小时。按常规方法接种长满单层的ST细胞（接种前用pH7.4的PBS洗三次），按照10%的比例接种病毒，37℃吸附1小时，补足细胞维持液（含10µg/ml的胰酶），37℃温箱培养。如此操作盲传至第10代，观察是否产生CPE。同时设置空白细胞作为对照。盲传传至第8代时细胞出现轻微的CPE变化，传至第17代时则出现明显、稳定的CPE变化，细胞圆缩，颗粒增加，聚堆呈葡萄串样，细胞出现损伤和脱落（图1）。二、将第17代病毒进行RT-PCR检测参考行业标准SN/T1446-2010中反转录聚合酶链式反应方法进行（SOP）。即根据S基因设计检测引物对：S-F:5’-TATTTGTGGTYTTGGTYGTAATGC-3’；S-R:5’-GGCTGTTTGGTAACTAATTTRCCA-3’，以95℃45S、50℃45S、72℃1min进行32个循环后，72℃延伸5min。扩增S基因片段为886bp，结果见图2。扩增ORF3序列的引物为：ORF3-F:AATTGAAAAAGTGCACGTCC-3’；ORF3-R:CAACAGGACCCAGAAAATGA-3’。扩增的片段的大小为1202bp（图3）。三、病毒含量测定将第17代病毒用DMEM维持液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，每个稀释度分别接种长满ST细胞单层的96孔细胞板6孔，100μl/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37℃5%CO2培养箱培养72～120小时，观察细胞病变，细胞颗粒增多，圆缩，细胞破损，脱落判为感染。同时阴性对照组细胞孔应不出现细胞病变。采用Reed-Muench法，计算TCID50。经测定，病毒含量为105.0TCID50/ml。四、动物实验取TGEV、PEDV中和抗体均小于1:8的母猪所产的3～5日龄仔猪5头，每头口服2ml第17代病毒，观察7日，统计接种猪的发病情况，对试验猪进行剖检，观察病理变化。刮取发病猪肠粘膜和内容物，提取RNA，按实施例1第二步提到的检测S基因设计的引物，进行RT-PCR检测，并将PCR产物进行序列测定。结果仔猪3/5发病，发病猪表现为腹泻，个别猪出现呕吐，剖检观察发现胃和小肠出现典型的病理变化。从发病猪的肠粘膜及内容物中可扩增出886bp的片段，经序列分析为TGEVS基因。经实验室分离鉴定，已成功的从河北某猪场腹泻猪小肠内容物中分离到猪传染性胃肠炎病毒。实施例2猪传染性胃肠炎病毒致弱一、猪传染性胃肠炎病毒的致弱培育将分离到的猪传染性胃肠炎病毒在ST细胞上连续传代120代，并在此过程进行了克隆纯化，然后继续在ST细胞上传代至165代。将第165代病毒进行RT-PCR检测，扩增S基因片段为886bp。TGEVORF3基因序列在第20代、40代、70代、100代处于比较稳定的的状态，有个别碱基的变化，但没有改变氨基酸；而第125代开始ORF3基因连同前面的间隔区序列出现81个核苷酸的缺失（起始密码子前30个核苷酸、后51个核苷酸连续81个核苷酸缺失），第125代、145代、165代稳定缺失81个核苷酸（序列如SEQIDNo.5所示）。结果如图4。将第20代、40代、70代、90代、100代、125代、135代、145代、155代及165代病毒分别用DMEM培养液作10倍系列稀释，各代次取适当稀释度，每个稀释度分别接种长满ST细胞单层的96孔细胞板6孔，100μl/孔，同时设阴性对照细胞6孔，37℃5%CO2培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株猪传染性胃肠炎病毒弱毒株HB08株，其保藏号为CGMCC?No.7807。

【技术特征摘要】
1.一株猪传染性胃肠炎病毒弱毒株HB08株，其保藏号为CGMCCNo.7807。2.含有权利要求1所述毒株的猪传染性胃肠炎病毒活疫苗。3.如权利要求2所述的活...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯艳红，王贵华，赵亚荣，于萍萍，刘明明，卢会英，满坤，陈翠云，
申请(专利权)人：北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心，北京科牧丰生物制药有限公司，福州大北农生物技术有限公司，北京大北农科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：