一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，通过副溶血性弧菌阳性标本制备、副溶血性弧菌浓缩富集、副溶血性弧菌核酸提取、引物设计、模板制备、基因扩增和PCR产物分析等步骤完成。本发明专利技术实现了水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌鉴定方法，这种方法省时，省力，检测灵敏度高，能够很好满足人们对水产养殖鱼类等日益严格的质量要求，并且这种方法对于其他致病微生物的检测具有指导意义。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种水产养殖动物体内残留副溶血性弧菌PCR检测方法，其特征在于，检测步骤包括：（1）副溶血性弧菌阳性标本制备：取300～800ml，浓度为5000cell/ml的副溶血性弧菌原液加入1m3，含10条15～20cm的鲅鱼海水鱼缸中，成为人为模拟的阳性标本；（2）副溶血性弧菌浓缩富集：分别取阳性标本和待测样本各4～5条，阳性标本和待测样本分别取20～100g的鱼鳞，将所取鱼鳞分别加入pH为7.5的甘氨酸缓冲液中，搅拌均匀后室温放置，再在2～4℃下以5 000转/分的转速离心，取上清并调节pH为7.0，在2～4℃静置2 h，以8 000转/分的转速离心，将离心后的沉淀用15mL pH为6.75的磷酸盐缓冲液重悬；（3）副溶血性弧菌核酸提取：将步骤（2）中5～10ml溶液用凯杰DNA提取试剂盒提取DNA；（4）引物设计：上游引物AGACAACTATGATGCAGATTA  下游引物TGATCATCACGATAGAAATAG；（5）模板制备：将步骤（3）中获得的提取液在‑4℃下以4000转/分的转速离心，取沉淀，一定温度下放置15～30分钟；（6）基因扩增：将步骤（5）中制备的模板放置于PCR扩增体系中进行基因扩增；（7）PCR产物分析：将步骤（6）中的扩增产物进行凝胶电泳，凝胶成像仪观察DNA带，与阳性标本DNA带比较即可判断待测样本中是否具有检测限以上的副溶血性弧菌。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜伟林，
申请(专利权)人：苏州市相城区新时代特种水产养殖场，
类型：发明
国别省市：江苏;32