抗神经生长因子抗体及其制备和使用方法技术

一种制备适用于猫的抗体的方法，包括以下步骤：从猫以外的物种提供供体抗体，其中所述供体抗体对所述猫中存在的靶抗原具有结合特异性；将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个猫抗体框架区氨基酸序列中对应位置存在的每一氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体抗体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个猫抗体框架区氨基酸序列内对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及用所述一个或多个猫抗体中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基取代所述供体抗体中的一个或多个鉴别出的氨基酸残基。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了一种制备适用于猫的抗体的方法。还提供了与猫神经生长因子(NGF)特异性结合且中和猫NGF结合p75或TrkA猫NGF受体能力的嵌合抗体和猫源化抗体。本专利技术延及编码所述抗体的核酸和使用所述抗体和/或核酸治疗猫疼痛和关节炎的方法。【专利说明】
本专利技术涉及充当猫神经生长因子的拮抗剂抗体及其片段。本专利技术还涉及制备这些抗体的方法以及这些抗体和片段在治疗猫的与神经生长因子相关的病症中的治疗用途，例如疼痛、疼痛相关病症以及导致疼痛发作的病症。
技术介绍
神经生长因子(NGF)是天然存在的分泌蛋白，其由α多肽链、β多肽链和Y多肽链构成。NGF是神经营养因子家族的成员，其参与许多不同的作用。NGF促进感觉神经元和交感神经元的生存和分化，并且通过两类膜结合受体即低亲和性NGF受体ρ75和高亲和性NGF受体跨膜酪氨酸激酶TrkA来传达信号。NGF与TrkA或ρ75的结合导致感觉神经元中神经肽的上调。 已经描述了使用NGF拮抗剂治疗人类的疼痛和疼痛敏感(Cattaneo A.、Curr.0p.Mol.Ther.201012(1):94-106)。例如，国际专利申请W02006/131951描述了人源化形式的大鼠aDll(aDll)单克隆抗体。a Dll抗体对小鼠NGF具有结合特异性，但已知也与人类和大鼠形式的NGF结合。在施用至人之前，需要对a Dll大鼠衍生单克隆抗体进行人源化，从而使产生的中和抗体最少，该中和抗体是由人类对啮齿类衍生抗体的抗大鼠抗体(HAMA)反应产生的。而且，用人恒定结构域取代小鼠恒定结构域允许选择下游效应子功能。目前，通过施用数种镇痛剂包括局部和全身麻醉剂、麻醉性镇痛剂、α2拮抗剂、非类固醇抗炎药(NSAIDs)和类固醇来进行猫的疼痛管理。这些药物中的每一种都需要频繁地施用并且在功效和安全性方面也有局限性。因此，对于患有慢性疼痛例如患有神经病理性疼痛或肿瘤疼痛的猫，需要不频繁施用且持久有效的疼痛缓解。虽然NGF在猫组织中表达，但只有部分克隆是可用的序列。该部分mRNA序列在 GenBank 登录 EF065101 (URL:http://www.ncb1.nlm.nih.gov.Felis catus nervegrowth factor beta-like mRNA,猫神经生长因子-β类mRNA)中限定。但该文章既没有描述猫NGF的拮抗剂，也没有在猫中使用阻塞NGF介导的信号传导以防止或缓解疼痛。由于无法确定与另一物种中表达的神经生长因子具有结合特异性的抗体是否也结合猫神经生长因子，因此在猫中使用在其他物种中充当抗NGF拮抗剂的已知抗体并不可行。而且，由于所施用的抗体将被猫免疫系统识别为外来的，因此也存在产生针对任何施用的抗体的中和抗体的可能性。另外，中和抗体的产生将限制该抗体的长期施用至猫，当治疗慢性疼痛相关病症或癌性病症时，这是特别重要的条件。此外，对猫施用来源于另一物种的抗NGF抗体可以显示与存在于猫中但并不存在于该抗体原始来源的物种中的其他靶表位的交叉反应。因此，迫切需要用于猫疼痛治疗中充当猫NGF拮抗剂的结合成员(binding member),其中该结合成员保持高水平的结合亲和性与亲合力，同时避免了针对其的中和抗体的产生。专利技术概述经过大量的努力，本专利技术人意外地发现了所制备的特异性结合猫NGF的非免疫原性嵌合抗体和猫源化抗体以及衍生自其的结合片段。特别是，出乎意料地，本文表明，本专利技术的抗体及其结合片段与猫NGF的结合，通过抑制猫NGF与高亲和性TrkA受体或与p75受体的结合，隔绝了猫NGF的生物活性。这反过来阻止了感知神经元中神经肽的上调，结果减轻或消除了痛觉。使用重组DNA方法生产抗体，使得该抗体基本上是非免疫原性的，也就是说，在施用至猫个体之后，针对该抗体的中和抗体并未产生。由于使用标准方法例如CDR移植等并未产生抗体，因此这样的发现是令人惊讶且完全出乎意料的。根据本专利技术的第一方面，提供了制备适合用于猫中的抗体的方法，其包括或基本上由以下步骤组成:从猫之外的物种提供供体抗体，其中所述供体抗体对猫中存在的靶抗原有结合特异性；将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个猫抗体的框架区的氨基酸序列中对应位置的每一氨基酸残基比较，以鉴别出所述供体受体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个猫抗体的框架区的氨基酸序列的对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及用存在于一个或多个猫抗体中对应位置的一个或多个氨基酸残基来取代所述供体抗体中一个或多个鉴别出的氨基酸残基。本专利技术的方法修饰了猫中使用的供体抗体，这样的方法使得修饰的抗体的框架区内的任何位置不含有在猫中的该位置将是外来的任何氨基酸。因此，修饰的抗体保持了供体抗体对靶抗原的特异性和亲和性，但重要的是修饰并没有产生潜在的外来表位。因此，在猫中，修饰的抗体不被看做外来的，并且尤其是在长期施用后，也没有在猫中引起可能导致抗体功效的中和的免疫反应。 在某些实施方案中，取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基的步骤包括，用存在于对应位置的与所述一个或多个取代的氨基酸残基具有最高同源性的一个或多个氨基酸残基来取代所述一个或多个鉴别出的氨基酸残基。在某些实施方案中，该方法还包括用来自猫抗体的重链和/或轻链的恒定结构域取代所述供体抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的步骤。通常，该重链的恒定结构域被HC2型猫恒定结构域取代。在某些实施方案中，靶表位是神经生长因子(NGF)。本专利技术第一方面的方法并不包括CDR移植。根据本专利技术第一方面的方法制备的抗体包含供体抗体的CDR、根据本专利技术的第一方面的方法制备的猫源化框架区，以及猫的恒定结构域。根据本专利技术的第二方面，提供了特异性结合猫神经生长因子(NGF)的嵌合抗体或其结合片段，所述嵌合抗体包含来源于与猫之外的物种中的神经生长因子结合的抗体的轻链和/或重链可变结构域，和从猫衍生抗体中获得的轻链和重链可变结构域。通常，当嵌合抗体或衍生自其的结合片段在结合表位结合猫NGF时，会中和NGF生物功能。也就是说，嵌合抗体或结合片段与猫NGF的结合隔绝了 NGF与TrkA受体或与p75受体结合的能力。在某些实施方案中，嵌合抗体或其结合片段与NGF结合的结合亲和力KD为1χ10_8或更小。在本专利技术的一个实施方案中，提供了抗猫NGF嵌合抗体或其结合片段，其能够与猫NGF结合并中和猫NGF与p75或TrkA猫NGF受体结合的能力，该嵌合抗体包含轻链和/或重链，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或与其具有至少85、90、95或99%序列同一性的氨基酸序列，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO: 2或与其具有至少85、90、95或99%氨基酸同一'I"生的序列。SEQ ID NO:2的重链恒定结构域衍生自来源于猫(Felis catus)的抗体并且以GenBank登录号BAA32229.1保藏。在另一实施方案中，所述重链具有氨基酸序列SEQ ID NO: 16，其是与衍生自来源于猫且以GenBank登录号BAA32230.1保藏的抗体的重链恒定结构域结合的恒定结构域。通常，本专利技术的抗猫NGF嵌合抗体的恒定结构域并不介导与抗体恒定区相关的下游效应子功能，例如补体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备适用于猫的抗体的方法，包括以下步骤：从猫以外的物种提供供体抗体，其中所述供体抗体对所述猫中存在的靶抗原具有结合特异性；将所述供体抗体框架区氨基酸序列的每一氨基酸残基与一个或多个猫抗体框架区氨基酸序列中对应位置存在的每一氨基酸残基进行比较，以鉴别出所述供体抗体框架区氨基酸序列内与所述一个或多个猫抗体框架区氨基酸序列内对应位置的一个或多个氨基酸残基不同的一个或多个氨基酸残基；以及用所述一个或多个猫抗体中对应位置存在的一个或多个氨基酸残基取代所述供体抗体中的一个或多个鉴别出的氨基酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：大卫·吉尔芮，
申请(专利权)人：NVIP私人有限公司，
类型：
国别省市：