一种决明子多糖定量检测方法技术

一种决明子多糖定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）粉碎：将待测决明子进行粉碎，过20～80目筛得决明子粉料，干燥后备用；（2）脱脂去色：用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min后，静置30min，倒去上层清液；重复该步骤至上层清液无色后，固液分离得脱脂粉料；（3）热水提取：用80～100℃热水对脱脂粉料进行提取1～3小时，合并滤液获得提取液；（4）纯化处理：a.聚乙烯聚吡咯烷酮处理：按0.5～5g/100mL的浓度往步骤（3）的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌1～3小时后，过滤，合并滤液；将滤液加入去离子水，定容，得待测样品液；或，b.聚乙烯聚吡咯烷酮/醇沉处理：按0.5～5g/100mL的浓度往步骤（3）的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌1～3小时后，过滤，合并滤液；加入相当于滤液3倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，离心后取沉淀物；往沉淀物加入去离子水复溶，定容，得待测样品液；（5）测定：以混合单糖标准样品建立标准曲线，以苯酚?硫酸法测定待测样品液的多糖浓度，即为待测决明子的多糖浓度；所述混合单糖标准样品是由混合单糖配制而成，所述混合单糖包括摩尔百分数90%以上的甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖；甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比例为43:8:21:19。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于食品、药物分析领域，公开了。以决明子为原料，粉碎后，用丙酮浸泡脱脂去色，然后热水提取、过滤、浓缩，醇沉和聚乙烯聚吡咯烷酮处理除去多酚类和其他蛋白质，最后经离心、定容后得到决明子多糖。按照决明子多糖组成的单糖摩尔比，配制混合单糖标准样品，获得标准曲线回归方程，用显色法测定决明子多糖含量。采用本专利技术方法可对决明子多糖进行更为准确、快捷的定量检测。【专利说明】
本专利技术属于食品、药物分析领域，具体涉及。
技术介绍
目前，用于决明子多糖含量的测定方法主要借多糖的方法来测定决明子多糖的含量:包括显色法、同位素标记法、免疫学法、生物检测法、高效液相色谱-示差检测法和蒸发光散射检测法等。显色法不需要大型仪器、且操作简单，易满足快速测定的需要，因此广泛应用于决明子多糖的检测。例如蒽酮-硫酸法(钟先锋，谢明勇，黄桂东，决明子有效成分的提取.南昌大学学报，2004，28:96-98)和硫酸-苯酚法(郭晓强，颜军，部晓勇，徐光域，范春华，苟小军.决明子水溶性多糖的纯化及抗氧化活性研究.食品科学，2007，08:205-208)。但是显色法存在方法学干扰较大、重现性较差等缺点。首先，现有方法对于决明子含量的干扰物质考虑较少。常规决明子样品前处理方法“决明子-粉碎一脱脂一沸水提取一浓缩(得到粗多糖)一除蛋白一醇沉一离心转溶(得到精多糖)”，操作繁琐，样品量损失大。因此，对于显色法而言，找到影响最终结果的决明子干扰物，从而简化前处理步骤是非常必要的。聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)具有良好的生物安全性和吸附络合性，能够有效除去多酚物质、蛋白质，多酚类物质通过竞争吸附占据PVPP的吸附活性点，因此，多酚类物质被吸附的量远大于蛋白质(黎新明，崔英德，廖列文，PVPP对啤酒中多酚类物质和蛋白质的吸附作用比较.食品科学，2002，8:74-76)。目前PVPP已用于啤酒行业中除去多酚和蛋白质，从而提高稳定性(李超，刘东品，常智刚.PVPP吸附啤酒中多酚类物质的分析.酿酒科技，2009,02:110-112)。目前也有PVPP用于其他饮料中除去多酚物质的研究报道(易国斌，崔英德，廖列文，黎新明，PVPP吸附绿茶饮料中茶多酚的研究.食品科学.2001，22:14-16)。其次，决明子多糖为多种单糖按照一定比例组成，而现有方法一般以葡萄糖为标准品，通过建立标准曲线来获取决明子多糖含量，所以结果往往与真实值偏差较大。因此该类方法测定决明子多糖含量时，对照品的选择尤为重要。结合决明子多糖的理化性质，通过对前处理步骤、对照品的选择进行研究，研发一种标准化、简便化、快捷化的决明子专属的多糖定量检测方法，对于此类物质的生产、科研都具有重要意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的目的在于提供。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:，包括以下步骤:(I)粉碎:将待测决明子进行粉碎，过20?80目筛得到决明子粉料，干燥后备用；(2)脱脂去色:用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min后，静置30min，倒去上层清液；重复该步骤至上层清液无色后，固液分离得脱脂粉料；(3)热水提取:用80~100°C热水对脱脂粉料进行提取2~3小时，合并滤液获得提取液；(4)纯化处理:a.聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)处理:按0.5~5g/100mL的浓度往步骤(3)的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌I~3小时后，过滤，合并滤液；将滤液加入去离子水，定容，得待测样品液；或，b.聚乙烯聚吡咯烷酮/醇沉处理:按0.5~5g/100mL的浓度往步骤(3)的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌I~3小时后，过滤，合并滤液；缓慢加入相当于滤液3倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，离心后取沉淀物；往沉淀物加入去离子水复溶，定容，得待测样品液；(5)测定:以混合单糖标准样品建立标准曲线，以苯酚-硫酸法测定待测样品液的多糖浓度，即为待测决明子的多糖浓度；所述混合单糖标准样品是由混合单糖配制而成，所述混合单糖包括摩尔百分数90%以上的甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖；甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比例为43:8:21:19。步骤(1)所述的干燥后备用是将决明子粉料在60°C下干燥6小时，然后置于干燥器中备用。步骤(2)所 述的决明子粉料与丙酮的料液重量比为1: (15~30)。步骤(3)所述的脱脂粉料与热水的料液比为1: (20~35) (g/mL)。步骤(5)所述混合单糖在配成混合单糖标准样品前先于102°C烘干至恒重后备用。步骤(5)所述混合单糖还包括葡萄糖醛酸、氨基半乳糖和阿拉伯糖；所述甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比为43:4:1:8:21:19:5。步骤(5)所述的苯酚-硫酸法包括如下步骤:取ImL待测样品液加入具塞试管中，加入质量分数5%的苯酚溶液2mL，混匀，缓慢加入7mL浓硫酸，混匀，沸水浴15min，取出，冰水冷却至室温，在490nm处测定吸光值；根据吸光值及标准曲线确定样品液浓度。步骤(5)所述的苯酚-硫酸法是一种已公开并在本领域普遍使用的分析方法，如苯酚-硫酸法测定广东虫草菌丝体多糖含量(郑必胜，唐芳勇，闻文娟，李泰辉.苯酚-硫酸法测定广东虫草菌丝体多糖含量的研究.2008，08:17-21)、苯酚-硫酸法测定胶囊中多糖含量(司梁宏，张梅，马丹华，谈恒山.苯酚-硫酸显色法测定枸杞益肾胶囊中多糖的含量.中国医院药学杂志，2007，27 (6):836-837)。故任何可达到本专利技术该步骤目的，具体操作不同的苯酚-硫酸法，都应包含在本专利技术的保护范围之内。决明子待测样品液可采用Folin-Ciocalteau (FC)法测量总多酹物质，采用Bicinchoninic acid(BCA)法测定蛋白质。多糖、总多酹、蛋白质分别表示以波长490nm、765nm、562nm处的吸光度结合标准曲线计算浓度。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果:(I)结合决明子多糖的理化性质，通过对前处理步骤、标准样品的选择进行研究，提供一种标准化、简便化、快捷化的决明子专属的多糖定量检测方法，对于此类物质的生产、科研都具有重要意义。(2)决明子多糖为多种单糖按照一定比例组成，按照决明子多糖组成的单糖摩尔t匕，建立混合单糖标准曲线，从而测定得到的决明子多糖含量与真实值偏差最小。【专利附图】【附图说明】图1实施例4、5及对比例2的测定多糖、总多酚以及蛋白质浓度的吸光度值；图2葡萄糖、混合单糖I (甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖)和混合单糖II (甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖)的标准曲线及公式。【具体实施方式】下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例1取5克决明子粉碎过20目筛，得到样品决明子粉料。按照料液比1:15 (w/w)用丙酮浸泡决明子粉料,振摇30min,静置30min ;倒去上层清液，再按相同料液比重复操作，至上层无色，固液分离得决明子脱脂粉料。经丙酮处理过的决明子脱脂粉料按照料液比1:35 (g/mL)，用80°C热水提取3小时，合并滤液得提取液。PVPP/醇沉处理:按浓度0.5g/100ml往提取液中添加PVPP，慢速搅拌I小时后，过滤，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种决明子多糖定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）粉碎：将待测决明子进行粉碎，过20～80目筛得决明子粉料，干燥后备用；（2）脱脂去色：用丙酮浸泡决明子粉料，振摇30min后，静置30min，倒去上层清液；重复该步骤至上层清液无色后，固液分离得脱脂粉料；（3）热水提取：用80～100℃热水对脱脂粉料进行提取1～3小时，合并滤液获得提取液；（4）纯化处理：a.聚乙烯聚吡咯烷酮处理：按0.5～5g/100mL的浓度往步骤（3）的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌1～3小时后，过滤，合并滤液；将滤液加入去离子水，定容，得待测样品液；或，b.聚乙烯聚吡咯烷酮/醇沉处理：按0.5～5g/100mL的浓度往步骤（3）的提取液中加入聚乙烯聚吡咯烷酮，慢速搅拌1～3小时后，过滤，合并滤液；加入相当于滤液3倍体积的无水乙醇，室温静置4小时，离心后取沉淀物；往沉淀物加入去离子水复溶，定容，得待测样品液；（5）测定：以混合单糖标准样品建立标准曲线，以苯酚?硫酸法测定待测样品液的多糖浓度，即为待测决明子的多糖浓度；所述混合单糖标准样品是由混合单糖配制而成，所述混合单糖包括摩尔百分数90%以上的甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖；甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖的摩尔比例为43:8:21:19。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：姚松君，高新开，熊斌，
申请(专利权)人：无限极中国有限公司，
类型：发明
国别省市：