一种化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，即第745个氨基酸至第877个氨基酸，共133个氨基酸，在该基因片段的5“端增加了BamH?I酶切位点（下划线部分），在3“端增加了终止密码子TGA和Xho?I酶切位点（下划线部分），化学合成的基因序列全长414bp，序列如下：GGATCC??GGT?CAG?AAC?AGC?GGT?AAC?CAG?TCG?TTT?GAA?GAA?GAC?ACG?GAA?GAA?GAT?AAG?CCG?AAG?TAT?GAA?CAG?GGT?GGC?AAC?ATT?GTG?GAC?ATT?GAT?TTT?GAC?AGT?GTC?CCG?CAG?ATT?CAT?GGC?CAA?AAC?AAA?GGT?AAT?CAG?TCC?TTC?GAA?GAA?GAC?ACC?GAA?AAA?GAT?AAG?CCG?AAA?TAT?GAA?CAC?GGC?GGT?AAC?ATT?ATC?GAT?ATT?GAC?TTT?GAT?AGC?GTT?CCG?CAT?ATC?CAC?GGC?TTC?AAC?AAG?CAT?ACC?GAA?ATT?ATC?GAA?GAA?GAC?ACG?AAT?AAG?GAT?AAA?CCG?AGC?TAC?CAA?TTT?GGC?GGT?CAC?AAT?TCT?GTG?GAC?TTC?GAA?GAA?GAT?ACG?CTG?CCG?AAA?GTT?TCC?GGT?CAG?AAC?GAA?GGC?CAG?CAG?ACG?ATT?GAA?GAA?GAC?ACG?ACG?CCG?CCG?ATT?GTT?TGA?CTCGAG。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段及其表达、应用涉及的是基因工程技术、抗体和试剂盒领域。本专利技术是通过计算机分析，筛选出金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA内的强抗原表位，第745个氨基酸至第877个氨基酸，共133个氨基酸，选择原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的强抗原表位片段。表达的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的强抗原表位片段，可用于金黄色葡萄球菌抗体的检测及用于免疫制备抗金黄色葡萄球菌的单抗和多抗等。【专利说明】化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表达、应用
本专利技术涉及的是化学合成的金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA基因片段及其表达、应用，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的表面蛋白FnBPA。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的FnBPA片段，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立等，本专利技术涉及基因工程技术和诊断试剂领域。
技术介绍
金黄色葡萄球菌是一种能引起人类和动物疾病的条件致病菌。它作为正常菌群寄生于人类皮肤和粘膜表面，占医院感染和社区获得性感染的大部分。金葡菌能引起皮肤和软组织感染，以及危及生命的转移性并发症，如肺炎、菌血症，心内膜炎，化脓性关节炎和骨髓炎，它广泛存留于医院，引起免疫系统损伤的宿主和手术病人感染，并存留医疗器械中。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因此，奶、肉、蛋、鱼及其制品等食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌也是各级卫生机构重点检测的病原体之一。因此，建立金黄色葡萄球菌的快速检测方法非常重要。传统鉴定和分离金黄色葡萄球菌的方法步骤较多，并且具有一定的局限性。首先要根据被检测的致病菌类型对样品进行富集培养，其鉴定结果一般只能定性不能定量，并且所需时间长，速度慢，一般3~4d才能推测结果，准确鉴定需要5~7天。大多数免疫学技术例如荧光标记抗体实验、酶联免疫试验(ELISA)、放射性免疫试验等都得到广泛应用，但它们所需成本较高、耗时且对样品进行复杂的处理，限制其在生活中的广泛应用。建立一种简单、快速、适合现场应用的金黄色葡萄球菌的检测方法有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术是化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组金黄色葡萄球菌的FnBPA的部分片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的部分片段，第745个氨基酸一第877个氨基酸，共133个氨基酸，选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术在大肠杆菌BL21中表达该基因。表达的蛋白可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，为金黄色葡萄球菌检测方法的建立奠定了基础。金黄色葡萄球菌产生的细胞外结合基质蛋白(ECMBP)，包括FnBP、ClfA和Ebp等，它们均为细菌表面的蛋白成分，具有相似的结构。FnbpA是纤连蛋白结合蛋白(Fnbp)的一种，是细菌表面的蛋白质成分。通过对金黄色葡萄球菌临床分离株Fnbp的双重PCR检测，发现95%以上的菌株存在粘附素基因FnbpA而FnbpB基因仅有10%，本研究选用FnBPA作为研究对象。通过计算机软件分析，筛选出金黄色葡萄球菌的特异性表面蛋白FnPFA抗原表位富集区，选择原核生物偏爱的密码子优化基因序列，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达。表达的蛋白具有较好的抗原性和特异性，可用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备，为金黄色葡萄球菌快速检测方法的建立奠定基础。化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的133个氨基酸的基因片段及其表达、应用是采取以下步骤实现的: 1.金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成: 利用ANTHEWIN、DNAStar等软件，通过计算机分析金葡菌表面蛋白FnBPA的全氨基酸序列，发金葡菌表面蛋白FnBPA的N端(第745氨基酸一第877氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择原核生物偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了酶切位点(下画线部分)，在3’端增加了终止密码子(TGA)和ZA0 I酶切位点(下画线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒PGEX4T-2饱BamH I和ZAo I酶切位点内。筛选的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA内的抗原表位氨基酸序列(第745个aa —第 877 个 aa):【权利要求】1.一种化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，即第745个氨基酸至第877个氨基酸，共133个氨基酸，在该基因片段的5’端增加了 I酶切位点(下划线部分)，在3’端增加了终止密码子TGA和ZA0 I酶切位点(下划线部分)，化学合成的基因序列全长414bp，序列如下: 2.权利要求1所述的化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下: 金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段重组质粒的构建: 用BernH I和通ο I双酶切质粒pGEX4T_2和化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，电泳回收后，用T4 DNA连接酶连接，使金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段插入到载体PGEX4T-2内的BeuM I和Xho I位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长359个氨基酸，该融合蛋白N端融合了载体上的226个氨基酸，C端包含金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA内的第745个氨基酸至第877个氨基酸，全长氨基酸序列如下:3.权利要求1所述的化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。4.权利要求2或权利要求3所述的方法制备的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA片段，用于金黄色葡萄球菌抗体检测及单抗和多抗的制备，并用于胶体金试剂条的组装。【文档编号】C07K14/31GK103725697SQ201310750813【公开日】2014年4月16日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日 【专利技术者】李越希, 李丙军, 许桂丽, 马颖, 张素芬, 袁敬宇, 徐悦玥, 潘英, 李素芹, 陈乐如, 蔡冉, 周洁, 尚彦红 申请人:李越希本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种化学合成的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA的基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的金黄色葡萄球菌表面蛋白FnBPA基因片段，即第745个氨基酸至第877个氨基酸，共133个氨基酸，在该基因片段的5“端增加了BamH?I酶切位点（下划线部分），在3“端增加了终止密码子TGA和Xho?I酶切位点（下划线部分），化学合成的基因序列全长414bp，序列如下：GGATCC??GGT?CAG?AAC?AGC?GGT?AAC?CAG?TCG?TTT?GAA?GAA?GAC?ACG?GAA?GAA?GAT?AAG?CCG?AAG?TAT?GAA?CAG?GGT?GGC?AAC?ATT?GTG?GAC?ATT?GAT?TTT?GAC?AGT?GTC?CCG?CAG?ATT?CAT?GGC?CAA?AAC?AAA?GGT?AAT?CAG?TCC?TTC?GAA?GAA?GAC?ACC?GAA?AAA?GAT?AAG?CCG?AAA?TAT?GAA?CAC?GGC?GGT?AAC?ATT?ATC?GAT?ATT?GAC?TTT?GAT?AGC?GTT?CCG?CAT?ATC?CAC?GGC?TTC?AAC?AAG?CAT?ACC?GAA?ATT?ATC?GAA?GAA?GAC?ACG?AAT?AAG?GAT?AAA?CCG?AGC?TAC?CAA?TTT?GGC?GGT?CAC?AAT?TCT?GTG?GAC?TTC?GAA?GAA?GAT?ACG?CTG?CCG?AAA?GTT?TCC?GGT?CAG?AAC?GAA?GGC?CAG?CAG?ACG?ATT?GAA?GAA?GAC?ACG?ACG?CCG?CCG?ATT?GTT?TGA?CTCGAG。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李越希，李丙军，许桂丽，马颖，张素芬，袁敬宇，徐悦玥，潘英，李素芹，陈乐如，蔡冉，周洁，尚彦红，
申请(专利权)人：李越希，
类型：发明
国别省市：
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