本发明专利技术公开了一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3）使用霍乱弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸,多次进行反应，观察它们的阴阳性。本发明专利技术通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测霍乱弧菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3）使用霍乱弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸,多次进行反应，观察它们的阴阳性。本专利技术通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测霍乱弧菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。【专利说明】
本专利技术涉及疾病检测
，具体的说，是。
技术介绍
霍乱(cholera)是一种烈性肠道传染病，两种甲类传染病之一，由霍乱弧菌(Vibrio cholerae)污染水和食物而引起传播。临床上以起病急骤、剧烈湾吐、排泄大量米泔水样肠内容物、脱水、肌痉挛少尿和无尿为特征。霍乱弧菌的感染源主要为受污染的饮食为主，快速检测饮食中的霍乱弧菌，对预防食物中毒以及确定有效治疗方案具有很大意义。环介导等温扩增技术是由日本荣研(EIKEN)株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本专利技术结合环介导等温扩增技术，设计针对霍乱弧菌特异性基因序列的一对外引物(V-F3和V -B3)和一对内引物(V -FIP和V -BIP)进行环介导等温扩增。
技术实现思路
本专利技术公开了，提高了它的检测和诊断效率。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现:，包括以下步骤:步骤1)制备反应液反应液组成及含量为8u/ul Bst核酸聚合酶8u10X耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱1M10mM d-NTP 混合液400 μ Μ内引物V-FIP40umolV-BIP40umol外引物V-F35umolV-B35umol标本核酸20ng添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；步骤3)使用霍乱弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。进一步的，所述外引物V-F3的序列为CTGCTAACGTTGGCTTTG。进一步的，所述外引物V-B3的序列为GGCTTTATTTTCGAAATAGGGC。 进一步的，所述内引物V-FIP的序列为 CCGTTGTTTCAATATTGGCATACC-TTATATGCTCAATGATAGCTGGTo进一步的，所述内引物V-BIP 的序列为 AGCAGGTGCAGATGCCAAAT-GTTAGAACTTATAACCACCCG。 进一步的，所述反应液中加入突光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。本专利技术的有益效果是: 本专利技术通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测霍乱弧菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。 【具体实施方式】下面将结合实施例，来详细说明本专利技术。，包括以下步骤: 步骤I)制备反应液 反应液组成及含量为 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 内引物 V-FIP40umol V-BIP40umol 外引物 V-F35umol V-B35umol标本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul。选取霍乱弧菌的特异性基因astA (基因序列来源美国国立生物技术信息中心-NCBI)，设计引物序列。所述外引物V-F3的序列为CTGCTAACGTTGGCTTTG，所述外引物V-B3的序列为GGCTTTATTTTCGAAATAGGGC，所述内引物V-FIP的序列为 CCGTTGTTTCAATATTGGCATACC-TTATATGCTCAATGATAGCTGGT,所述内引物 V-BIP 的序列为AGCAGGTGCAGATGCCAAAT-GTTAGAACTTATAACCACCCG。进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性； 步骤3)使用霍乱弧菌3株的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。结果显示:3株霍乱弧菌的核酸每次均为阳性，其余菌种为阴性。以上所述仅为本专利技术的优选实施例而已，并不用于限制本专利技术，对于本领域的技术人员来说，本专利技术可以有各种更改和变化。凡在本专利技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。【权利要求】1.，其特征在于，包括以下步骤:步骤1)制备反应液反应液组成及含量为8u/ul Bst核酸聚合酶8u10X耐热聚合酶反应缓冲液lX，MgS04 2mM4M甜菜碱1M10mM d-NTP 混合液400 μ Μ内引物V-FIP40umolV-BIP40umol外引物V-F35umolV-B35umol标本核酸20ng添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;`步骤2)将上述反应液放入63°C烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性；步骤3)使用霍乱弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述外引物 V-F3 的序列为 CTGCTAACGTTGGCTTTG。3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述外引物 V-B3 的序列为 GGCTTTAITTTCGAAATAGGGC。4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述内引物V-FIP的序列为CCGTTGTTTCAATATTGGCATACC-TTATATGCTCAATGATAGCTGGTo5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述内引物 V-BIP 的序列为 AGCAGGTGCAGATGCCAAAT-GTTAGAACTTATAACCACCCG。6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法，其特征在于:所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。【文档编号】C12Q1/68GK103725767SQ201210385900【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月12日 优先权日:2012年10月12日 【专利技术者】金京勋 申请人:苏州市贝克生物科技有限公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高特异高敏感检测霍乱弧菌的方法,其特征在于，包括以下步骤：步骤1）制备反应液反应液组成及含量为8u/ul Bst核酸聚合酶 8u10X耐热聚合酶反应缓冲液 1X,MgSO4 2mM4M 甜菜碱 1M10mM d‑NTP混合液 400μM内引物 V‑FIP 40umol V‑BIP 40umol外引物 V‑F3 5umol V‑B3 5umol标本核酸 20ng添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30‑60min，浑浊为阳性;步骤3）使用霍乱弧菌的核酸，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸,多次进行反应，观察它们的阴阳性。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金京勋，
申请(专利权)人：苏州市贝克生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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