一种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的腺苷检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的腺苷检测方法，生物素修饰的腺苷核酸适配体和生物素修饰的酪蛋白通过生物素-亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球；将辣根过氧化物酶和巯基修饰的捕获探针修饰到纳米颗粒上作为信号标记；将功能化纳米颗粒流入微流控微珠阵列检测芯片的检测区与微珠阵列杂交，洗脱后流入腺苷溶液与杂交微球孵育；流入过氧化物酶底物溶液，将生物素化的酪胺结合到微球表面的酪蛋白上，洗脱后流入亲合素标记的量子点；通过计算流入腺苷后微球表面荧光与未流入腺苷微球表面荧光的比值对腺苷进行定性和定量。本发明专利技术可高灵敏检测分析目标，实现了血清样品中腺苷的特异及准确的定量分析。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，生物素修饰的腺苷核酸适配体和生物素修饰的酪蛋白通过生物素-亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球；将辣根过氧化物酶和巯基修饰的捕获探针修饰到纳米颗粒上作为信号标记；将功能化纳米颗粒流入微流控微珠阵列检测芯片的检测区与微珠阵列杂交，洗脱后流入腺苷溶液与杂交微球孵育；流入过氧化物酶底物溶液，将生物素化的酪胺结合到微球表面的酪蛋白上，洗脱后流入亲合素标记的量子点；通过计算流入腺苷后微球表面荧光与未流入腺苷微球表面荧光的比值对腺苷进行定性和定量。本专利技术可高灵敏检测分析目标，实现了血清样品中腺苷的特异及准确的定量分析。【专利说明】—种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的腺苷检测方法
本专利技术属于微全分析系统的生物学检测
，涉及。
技术介绍
腺苷是一种内源性核苷，因其在中枢神经和周围神经系统信号表达中的重要作用，受到广泛关注及研究。同时腺苷作为腺苷脱氨酶的作用底物，其含量变化也会间接反应腺苷脱氨酶的体内代谢水平，而腺苷脱氨酶活性的检测对于临床许多疾病的诊断都具有重要参考价值，因此发展腺苷的新型检测方法对于医学临床诊断及机体代谢水平具有重要意义。传统腺苷检测方法主要为HPLC、紫外检测、流式检测法及荧光分析法等技术，这类技术检测灵敏度有限，而且需要较大体积的检测溶液，使得在高灵敏微量分析领域的应用受到局限。微流控微珠阵列芯片是微流控芯片研究领域中发展的一种新型芯片模式，该技术的发展较好解决了微量样品条件下高通量、高灵敏检测的难题，同时检测过程简单，不需要昂贵的检测仪器，为发展未来自动化高性能生物分子检测平台技术提供了新的方向。核酸适配体是指通过指数富集配体系统进化技术(SELEX)从随机单链寡聚核苷酸文库中筛选的能特异结合蛋白或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸，长度一般为25-60个核苷酸。与抗体相比，核酸适配体具有易合成、易修饰、易固定、可反复使用、可长期保存及没有或极小的免疫原性等特点，而且与目标分子结合表现出高效、专一的特性，因而核酸适配体生物传感器在蛋白质研究、药物检测、医学诊断等方面得到广泛应用。酶功能化纳米颗粒作为一种检测标记材料，由于一个纳米颗粒上能携带多个酶分子，已经成为信号放大
中的一种极具应用前景的信号放大方法。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺陷，本专利技术提供，将微流控芯片、核酸适配体识别、多酶纳米信号放大技术有机结合起来，发展了一种用于腺苷检测的高性能生物传感技术，将具有广阔的应用前景。其技术方案如下:，包括以下步骤:(I)生物素修饰的腺苷核酸适配体和生物素修饰的酪蛋白通过生物素-亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球，所述微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠阵列检测芯片；(2)将辣根过氧化物酶和巯基修饰的捕获探针修饰到纳米颗粒上作为信号标记；(3)将步骤(2)形成的功能化纳米颗粒流入微流控微珠阵列检测芯片的检测区与微珠阵列杂交，洗脱后流入腺苷溶液与杂交微球孵育，由于腺苷核酸适配体能与腺苷结合形成特定的空间构型，会导致功能化纳米颗粒从微球表面脱离；(4)流入过氧化物酶底物溶液，通过多酶纳米信号放大技术将生物素化的酪胺结合到微球表面的酪蛋白上，洗脱后流入亲合素标记的量子点，所述量子点能与微球表面酪蛋白上结合的生物素识别并固定；(5)通过计算流入腺苷后微球表面荧光与未流入腺苷微球表面荧光的比值对腺苷进行定性和定量。进一步优选，步骤(I)中所述的功能化微球表面修饰的生物素修饰的腺苷核酸适配体和生物素修饰的酪蛋白，其摩尔浓度比值为1: 100?1: 120。进一步优选，步骤(I)中所述的微球是二氧化硅微球、聚苯乙烯类有机聚合物微球、磁性微球和生物大分子聚合物微球中的任意一种。进一步优选，步骤(2)中所述的纳米颗粒为金纳米颗粒、二氧化硅纳米颗粒和聚苯乙烯纳米颗粒中的任意一种。进一步优选，步骤(3)中所述的腺苷溶液与杂交微球孵育，孵育时间为20?25min。进一步优选，步骤(4)中所述的过氧化物酶底物溶液包含0.007%?0.009% H2O2>250?350 μ M生物素化的酪胺、50?IOOmM的NaCl。进一步优选，步骤(4)中所述的量子点为CdSe、CdTe、CdS和复合型量子点中的一种，其发射范围为400nm?700nm。与现有技术相比，本专利技术的有益效果:本专利技术微流控芯片具有微量检测和高通灵敏检测的双重特性，能够较好的解决常规分析方法中微量检测、高灵敏检测以及高通量分析等性能难以兼容的问题，可实现微量样品的高灵敏分析；本专利技术采用多酶纳米信号放大及量子点荧光技术，可高灵敏检测分析目标，能够检测0.1pM的腺苷，而且实现了血清样品中腺苷的特异及准确的定量分析；本专利技术的建立为腺苷的微量及高灵敏检测提供了一种有力的检测手段。【专利附图】【附图说明】图1为本专利技术的基于微珠传感和核酸适配体识别技术的腺苷检测原理示意图；图2为本专利技术实施例的微流控芯片内外检测腺苷的灵敏度对比曲线图；图3为本专利技术实施例的血清样品检测结果。【具体实施方式】下面结合附图和具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案。参照图1，是本专利技术方法的原理示意图。图1所示的具体原理如下:首先，生物素修饰的核酸适配体3及生物素修饰的酪蛋白2按照一定比例修饰到亲和素修饰的微球表面1，制备出可用于腺苷检测的功能化微球4 ;流入修饰了辣根过氧化物酶(HRP)和捕获探针的功能纳米颗粒5，与芯片内的功能化微球杂交，捕获探针与核酸适配体通过杂交结合起来，将功能化纳米颗粒固定在微球表面6 ;流入目标分子腺苷7，腺苷与核酸适配体结合形成特定空间结构并将功能纳米颗粒从微球表面解离下来8 ;然后流入酶催化底物溶液，包含生物素化的酪胺9和双氧水，辣根过氧化物酶在双氧水存在下能催化生物素化的酪胺形成活性分子10，该生物素化的活性分子能与酪蛋白功能化微球表面携带的羟苯基团发生共价交联，从而形成生物素基团功能化的微球表面11 ;流入亲和素修饰的量子点12，量子点利用亲和素与生物素的结合特性固定在微球表面形成了识别微球13 ；最后根据识别微球表面荧光信号获取检测信息。下面是本专利技术实施例的具体实施过程:(I)酪蛋白的制备:将0.3-0.5g酪蛋白溶解在10mL150-200mM的NaHCO3溶液中，将溶解有2-4mg羟苯基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和0.5-1.0mg生物素化的琥珀酰亚胺酯的二甲基甲酰胺在搅动下逐滴加入到酪蛋白溶液中。混合溶液在室温下连续搅动lh，然后在去离子水中透析12-24h，再在磷酸缓冲液(20mM，pH7.6)中透析12_24h，溶液离心去除轻微的浑浊溶液，沉淀冻干备用。 (2)用于腺苷检测的功能化聚苯乙烯微珠的制备:采用10-30 μ m亲和素修饰聚苯乙烯微球作为核酸适配体固定的固相界面,取100 μ L浓度为1% -3%的亲和素修饰微球于离心管中，用 IOOyL 亲和洗脱液(20mM Tris ρΗ7.5，IM NaCl, ImM EDTA,0.0005%Triton X-100)洗涤两次，离心条件为3500rpm，5min，去上清；分别加入44 μ L的亲和洗脱液、3 μ L10-15 μ M的生物素化的酪蛋白及3 μ L0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于微流控芯片和核酸适配体识别技术的腺苷检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)生物素修饰的腺苷核酸适配体和生物素修饰的酪蛋白通过生物素?亲合素结合方法固定于亲合素修饰微球的表面形成功能化微球，所述微球固定在微流控芯片检测区的相应微型小室中，形成微流控微珠阵列检测芯片；(2)将辣根过氧化物酶和巯基修饰的捕获探针修饰到纳米颗粒上作为信号标记；(3)将步骤(2)形成的功能化纳米颗粒流入微流控微珠阵列检测芯片的检测区与微珠阵列杂交，洗脱后流入腺苷溶液与杂交微球孵育；(4)流入过氧化物酶底物溶液，通过多酶纳米信号放大技术将生物素化的酪胺结合到微球表面的酪蛋白上，洗脱后流入亲合素标记的量子点，所述量子点能与微球表面酪蛋白上结合的生物素识别并固定；(5)通过计算流入腺苷后微球表面荧光与未流入腺苷微球表面荧光的比值对腺苷进行定性和定量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张何，傅昕，胡鑫江，
申请(专利权)人：湖南工程学院，
类型：发明
国别省市：