一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用技术

本发明专利技术公开了一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用。本发明专利技术的一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法，包括收集高免蛋、高免蛋消毒、海藻酸钠除脂、硫酸铵沉淀、抗体的超滤膜浓缩和纯化以及灭活除菌等步骤。研究结果表明，本发明专利技术采用海藻酸钠除脂、硫酸铵沉淀提取得到的Ⅰ型和新型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，抗体纯度高、效价高、副反应小、治疗效果明显，能够安全方便的用于Ⅰ型以及新型鸭肝炎病毒的同时防治。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用。本专利技术的一种Ⅰ型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法，包括收集高免蛋、高免蛋消毒、海藻酸钠除脂、硫酸铵沉淀、抗体的超滤膜浓缩和纯化以及灭活除菌等步骤。研究结果表明，本专利技术采用海藻酸钠除脂、硫酸铵沉淀提取得到的Ⅰ型和新型鸭病毒性肝炎二价蛋黄抗体，抗体纯度高、效价高、副反应小、治疗效果明显，能够安全方便的用于Ⅰ型以及新型鸭肝炎病毒的同时防治。【专利说明】一种I型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用
本专利技术涉及一种卵黄抗体的制备方法，特别涉及一种I型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法及其产品和应用。本专利技术属于水禽用生物制品
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技术介绍
鸭甲型肝炎(Duck Hepatitis A, DHA)是由鸭甲型肝炎病毒(Duck Hepatitis AVirus, DHAV)引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。该病主要侵害I~3周龄的雏鸭，传播迅速，发病严重，临床症状主要表现为痉挛、抽搐和角弓反张，以肝脏肿胀和出血为主要病理变化。病鸭多在出现症状后的I小时内死亡，10日龄雏鸭感染后死亡率可达90%以上，该病已经成为严重危害养鸭业的主要疾病之一。鸭肝炎病毒包含嗜肝病毒科、星状病毒科和小核糖核酸病毒科3个病毒科的4种病毒。嗜肝病毒科的鸭肝炎病毒引起鸭乙型肝炎，其对鸭没有显著的致病性；星状病毒科引起II型鸭肝炎，目前为止仅英国有发病报道；目前我国流行的是由小核糖核酸病毒科引起的I型和新型鸭甲型肝炎。对于血清I型病毒，我国已经采用了多年的卵黄抗体进行预防和治疗，并取得了一定的效果，但今年来不断从病鸭中同时分离到I型和新型鸭肝炎病毒，证明我国多地出现血清I型和新型鸭肝炎混合感染的情况。血清中和试验表明，I型和新型之间缺乏交叉保护作用，I型卵黄抗体很难对流行的新型鸭肝炎病毒进行预防，I型和新型二价卵黄抗体是预防和控制鸭病毒性肝炎的必然要求，因此探讨I型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的提取方法对有效防治该病具有是十分重要的意义。卵黄抗体(egg yolk antibodies, IgY)是指产蛋鸡受特定抗原免疫后产生并转移和贮存在卵黄中的特异性抗体，从蛋黄中将IgY提取并应用在动物疾病的防治中已得到广泛认可。但IgY被广泛应用的前提是如何将卵黄中将大量的IgY提取、纯化出来。近年来，国内外学者报道了许多卵黄抗体的制备方法，但由于提取方法的不当，缺少抗体纯化过程，导致提取过程中，抗体大量损失，效价大幅降低，大量杂蛋白及脂肪等物质未被除去，同时存在提取药品的残留。其结果是一方面，造成抗体提取成本的提高；其另一方面，造成抗体注射困难、难以吸收、注射局部肿胀、过敏反应严重，直接导致抗体治疗效果不佳，严重影响抗体的使用效果，极大的限制了卵黄抗体在疾病防治上的应用。目前常采用的方法包括酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法以及辛酸法等，其中酸化水提取法除脂效果不佳，卵黄抗体中含有大量杂蛋白；聚乙二醇法中使用聚乙二醇易溶于水，目前尚没有办法去除，对畜禽有一定的危害，IgY含有一定杂蛋白，抗体纯度不高；氯仿法中使用氯仿有残留和毒性，对卵黄抗体的品质有较大影响，易引起注射部位肿胀，及动物全身不良反应；辛酸法 中辛酸在水中溶解度极低(0.062g/L),因此在水溶性物质中辛酸残留量极微。在医学工业中辛酸已被广泛应用，对生物不具毒副作用。但单纯使用辛酸萃提，蛋白纯度低，效价低，治疗效果不明显。
技术实现思路
针对现有技术中存在的种种技术缺陷，本专利技术所要解决的技术问题之一，是提供一种卵黄抗体的提取方法，以解决目前存在的由于提取方法的不当，缺少抗体纯化过程，导致提取过程中，抗体大量损失，效价大幅降低，大量杂蛋白及脂肪等物质未被除去，同时存在提取药品的残留的问题。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术手段为:本专利技术的一种卵黄抗体(egg yolk antibodies, IgY)的提取方法,其特征在于包括以下步骤:(1)收集高免蛋；(2)将高免蛋浸入新洁尔灭水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；(3)除脂量取卵黄体积，加入灭菌玻璃瓶内，按其体积的1.5-2.5倍加入海藻酸钠溶液，混合并调至PH5.0-5.2，置2~8°C保存过夜；其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.1-0.15% (w/w)的海藻酸钠以及0.02-0.08% (w/w)的NaCl，其余为纯化水；(4)盐析次日，吸取上清液，调pH7.2，加入硫酸铵至终浓度为28% (w/w),再搅拌均匀，离心，弃掉上清，沉淀用PBS缓冲液溶解沉淀；(5)抗体的纯化沉淀溶解液经截留分子量为50KD的超滤膜包过滤浓缩至原体积1/5，加入PBS缓冲液恢复至原体积再进行浓缩，反复3次，获得卵黄抗体原液，置2~8°C保存；(6)抗体的灭活除菌获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释后经甲醛溶液灭活，然后经滤膜过滤得到最终的卵黄抗体提取液。在本专利技术中，优选的，步骤(2)中是将高免蛋浸入1%。(v/v)新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，然后用甲醛熏蒸鸡蛋30分钟。在本专利技术中，优选的，步骤(3)中按所量取的卵黄体积的2倍加入海藻酸钠溶液，其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.12%的海藻酸钠以及0.05%的NaCl，其余为纯化水。在本专利技术中，优选的，步骤(4)或(5)中所述的PBS缓冲液为0.15mol/L的PBS缓冲液，PH7.2。在本专利技术中，优选的，步骤(6)中将获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释至病毒抗体中和效价≥1:512，经终浓度为0.04%(v/v)的甲醛溶液37°C灭活24h ;再用0.45 μ m滤膜过滤得到最终的卵黄抗体提取液。通过与目前普遍使用的卵黄抗体的提取方法，例如酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法相比，结果发现分别用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法和海藻酸钠硫酸铵法提取的IgY经SDS-PAGE电泳后，纯度存在明显差异，5种方法提取的IgY均在67kD和22kD左右，出现IgY的重链和轻链电泳条带，而用酸化水法、聚乙二醇法、氯仿法、辛酸法提取的IgY，还在34kD~55kD之间出现非目的蛋白的电泳条带。说明以上四种方法提取的IgY，含有杂蛋白，蛋白纯度较低，结果如图1所示。本专利技术所要解决的技术问题之二，是提供一种I型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法，以解决方法现有卵黄抗体提取方法中存在的抗体效价低，抗体纯度不高，治疗效果不佳的问题，同时提供一种能够同时对I型、新型鸭肝炎起到防治作用的二价卵黄抗体。为了达到上述目的，本专利技术采用的技术手段为:本专利技术的一种I型、新型鸭肝炎二价卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤:(I)收集高免蛋，所述的高免蛋中含有抗血清I型鸭肝炎病毒和新型鸭肝炎病毒的抗体；其中，所述的血清I型鸭肝炎病毒为鸭甲型肝炎病毒SD株，命名为DHAV-SD，分类命名为鸭甲型肝炎病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年12月9日，微生物保藏编号为=CGMCC N0.8560 ；所述的新本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种卵黄抗体（egg?yolk?antibodies，IgY）的提取方法，其特征在于包括以下步骤：（1）收集高免蛋；（2）将高免蛋浸入新洁尔灭水溶液中消毒，然后用甲醛熏蒸高免蛋，打破蛋壳，除去蛋清、胚盘和系带，收集卵黄；（3）除脂量取卵黄体积，加入灭菌玻璃瓶内，按其体积的1.5?2.5倍加入海藻酸钠溶液，混合并调至pH5.0?5.2，置2～8℃保存过夜；其中，所述的海藻酸钠溶液中，按重量百分比计，含有0.1?0.15％的海藻酸钠以及0.02?0.08％的NaC1，其余为纯化水；（4）盐析次日，吸取上清液，调pH7.2，加入硫酸铵至终浓度为28%，再搅拌均匀，离心，弃掉上清，沉淀用PBS缓冲液溶解沉淀；（5）抗体的纯化沉淀溶解液经截留分子量为50KD的超滤膜包过滤浓缩至原体积1/5，加入PBS缓冲液恢复至原体积再进行浓缩，反复3次，获得卵黄抗体原液，置2～8℃保存；（6）抗体的灭活除菌获得的卵黄抗体原液用灭菌生理盐水稀释后经甲醛溶液灭活，然后经滤膜过滤得到最终的卵黄抗体提取液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋扬，王彬，柴华，藏玉婷，于洪涛，闫冰，王昊，陈海娟，田野，戴金玲，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：