广藿香多倍体的诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种广藿香多倍体的诱导方法，本发明专利技术首次以广藿香愈伤组织再生的丛生芽为诱导材料，利用秋水仙素浸剂法将丛生芽的茎尖进行多倍体诱导，再将诱导后的茎尖去分化和再分化得多倍体植株。本发明专利技术的诱导材料结合所采用的诱导培养方法，显著提高了广藿香多倍体的诱导率，高达63.3%，成活率100%，以及降低了嵌合体的发生率，仅为10%。本发明专利技术获得的广藿香多倍体成稳定性好，经过无性扦插繁殖2代后，其性状仍与诱导当代相似。本发明专利技术获得的广藿香四倍体叶面积、茎等都较二倍体大许多，分枝数也更多，有利于提高广藿香油的产量，促进广藿香油品质的改善，实现广藿香优质高产的目的，满足人们对广藿香药材及其相关产品品质的需求。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，本专利技术首次以广藿香愈伤组织再生的丛生芽为诱导材料，利用秋水仙素浸剂法将丛生芽的茎尖进行多倍体诱导，再将诱导后的茎尖去分化和再分化得多倍体植株。本专利技术的诱导材料结合所采用的诱导培养方法，显著提高了广藿香多倍体的诱导率，高达63.3%，成活率100%，以及降低了嵌合体的发生率，仅为10%。本专利技术获得的广藿香多倍体成稳定性好，经过无性扦插繁殖2代后，其性状仍与诱导当代相似。本专利技术获得的广藿香四倍体叶面积、茎等都较二倍体大许多，分枝数也更多，有利于提高广藿香油的产量，促进广藿香油品质的改善，实现广藿香优质高产的目的，满足人们对广藿香药材及其相关产品品质的需求。【专利说明】
本专利技术涉及离体培养和秋水仙素处理结合选育多倍体的方法，具体涉及，属于多倍体育种
。
技术介绍
广藿香iPogostemon cab I in ( Blanco) Benth)为唇形科刺蕊草属多年生草本植物，被历代医家视为暑湿时令之要药，临床应用广泛，疗效较佳，是著名的道地南药。此外，从广藿香中提取的广藿香油还是医药工业和轻化工业的重要原料，可用于配制各种剂型、化妆护肤品、定香剂和杀虫剂等。广藿香引种到我国南亚热带地区种植后，由于气候等生态条件不同，引进我国栽培后罕见开花结籽，有时开了花，但花药败育，所以多采用扦插的繁殖方式。由于长期采用扦插繁殖，引起品种退化、植株生长缓慢、参差不齐，病虫害发生率高、抗逆性弱，导致产量及品质下降，迫切需要进行新品种选育。植物多倍体具有器官巨大性、抗逆性增强的特点，器官的增大不仅能提高相应部位入药的药材的产量，而且增加药材的品质，其有效成分含量相应增加，抗逆性也增强。广藿香入药部位是植株地上部分，其总挥发油含量主要分布在植株的叶片、茎中，对其进行多倍体育种是改进其品质的重要途径。多倍体主要来源于自然突变和人工诱变，其中人工诱变方法包括物理和化学方法。化学诱变中秋水仙素是最为常用的药剂之一，已成功在众多农作物、园艺植物和一些药用植物中诱导出多倍体并推广使用。常见的化学诱变剂有秋水仙碱和除草剂，如氨氟乐灵、氨磺乐灵、甲酰胺草磷、氧乐灵等，其中秋水仙碱是至今发现的加倍效果最好，使用最广泛的染色体加倍剂。应用组织培养技术培育多倍体是组织培养技术发展的一个新的领域，它是组织培养技术与秋水仙碱化学诱导技术的有机结合。化学诱变与组织培养的结合，使得多倍体诱导中融入了组织培养的优点，试验条件易于控制，且可以缩短育种时间，由于组织培养能实现快速繁殖，多倍·体诱导时可一次处理大量的植物材料，大大的加快了育种进程，可获得更多的多倍体材料，另外由于所选材料大多幼嫩，且处在分生状态的组织细胞，容易受秋水仙碱的影响，诱导成功率较高，且多倍体纯度高。常用的诱导方式有浸溃法、点滴法和混培法，以上三种方法各有利弊，对于不同植物材料的诱导也产生了不同的加倍效果。秋水仙碱是一种有毒试剂，处理不当会对植物造成伤害，秋水仙碱处理的浓度和时间因诱导的方法和材料的不同有所差异，其有效浓度为0.01%~1%，一般0.2%~0.4%应用最广。多倍体诱导方法早期研究主要采用原位诱导法，即把供试植物的种子、正在生长的幼苗、茎尖等在非离体条件下用不同浓度的诱变剂处理，从而诱导染色体加倍。处理的方法有浸泡法、注射法、涂抹法及包埋法等。尽管这些方法都能获得多倍体，但往往存在嵌合体几率高的现象。近年来随着生物技术的发展，离体培养加倍法开始盛行，从已有报道来看，该方法的主要途径有两条:一是在组织培养过程中，用秋水仙素水溶液直接处理培养材料；二是用含有秋水仙素的固体培养基将材料培养一段时间，再转入分化培养基，再由变异细胞分化出完整植株。离体加倍培养法由于试验条件易于控制，变异植株受环境影响造成的回复突变现象减少，试验结果重复性强。然而，多倍体诱导的关键问题之一是出现嵌合体，尽管嵌合体是诱导多倍体中一种较常见的现象，材料选取不当往往造成多倍体细胞比例少，很快被二倍体取代。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术通过选取特定的诱导材料、改进诱导和培养方法，建立了一种诱导率高、嵌合体发生率低的。本专利技术的目的在于提供一种。本专利技术所采取的技术方案是: 一种，其特征在于:包括以下步骤: 1)愈伤组织的诱导:取广藿香的叶片，消毒，洗净，在无菌条件下，剪成1~2cm2的小片，接种至愈伤组织培养基中，进行愈伤组织培养12~14天，获得愈伤组织； 2)丛生芽的诱导:在无菌条件下，将愈伤组织转接到丛生芽培养基中培养26~30天，获得丛生芽； 3)秋水仙素处理:在无菌条件下，剪取0.5~1cm长的丛生芽茎尖浸泡于0.3~0.5g.L-1的秋水仙素溶液中，黑暗条件下振荡24~72h ； 4)恢复培养:在无菌条件下，将秋水仙素处理后的丛生芽茎尖用无菌水洗干净，接种于愈伤组织培养基中培养12~14天后，再接种于丛生芽培养基中培养26~30天，获得多倍体丛生芽； 5)增殖培养:将多倍体丛生芽接种到新的丛生芽培养基中进行增殖培养20~25天； 6)多倍体鉴定:取增殖培养后丛生芽的茎尖进行染色体数目观察，在一个根尖上同时观察到5个以上分裂相染色体数目加倍，即可确证该变异株系为多倍体； 7)生根培养:在无菌条件下，将鉴定为多倍体的株系从基部切下，转接到生根培养基中培养8~15天，获得生根苗； 8)炼苗:取出生根苗，转接到装有蛭石和砂子的盆中，在室内炼苗培养28~40天； 9)移苗:炼苗后，将盆苗移到室外，或者将苗从盆中移栽到田间，遮上有70~85%遮阳率的阴棚，培养8~12天后，移去阴棚，进行田间栽培管理，即可。进一步的，上述所有的愈伤组织培养基包含MS基本培养基、0.1~0.3mg.L-16_ΒΑ、0.4 ~0.6 mg.L 1 NAA>30 ~32g.L 1 鹿糖和 6.0 ~7.0 g.L 1 琼脂。进一步的，上述所有的丛生芽培养基包含MS基础培养基、0.1~0.3mg -L-1 6-BA、30~32g.L-1鹿糖和6.0~7.0 g.L-1琼脂。进一步的，上述所有的生根培养基包含1/2MS基础培养基、0.1~0.3 mg -L-1 IBA、30~32g.L-1鹿糖和6.0~7.0 g.L-1琼脂。进一步的，上述所有的愈伤组织培养的条件为:温度28~30°C、光照强度为1000~1200Lx、光照周期8~12h光照/12~16h黑暗。进一步的，上述所有的丛生芽培养条件、生根培养条件、炼苗培养条件独立为:温度25°C~28°C、光照强度为1000~1200Lx、光照周期8~12h光照/12~16h黑暗。进一步的，步骤8)所述的蛭石和砂子的体积比为1: (1~1.5)。本专利技术的有益效果是:本专利技术首次以广藿香愈伤组织再生的丛生芽为诱导材料，利用秋水仙素浸泡法将丛生芽的茎尖进行多倍体诱导，再将诱导后的茎尖去分化和再分化，获得多倍体植株，诱导结果显示，本专利技术选取的诱导材料结合本专利技术采用的诱导和培养方法，显著提高了广藿香多倍体的诱导率(高达63.33% )、及降低了嵌合体的发生率(仅为10%)。本专利技术获得的广藿香多倍体成活率100%，且稳定性好，经过无性扦插繁殖2代后，其性状仍与诱导当代相似。本专利技术获得的广藿香植株较二倍体巨大，其叶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种广藿香多倍体的诱导方法，其特征在于：包括以下步骤：1）愈伤组织的诱导：取广藿香的叶片，消毒，洗净，在无菌条件下，剪成1～2cm2的小片，接种至愈伤组织培养基中培养12～14天，获得愈伤组织；2）丛生芽的诱导：在无菌条件下，将愈伤组织转接到丛生芽培养基中培养26～30天，获得丛生芽；3）秋水仙素处理：在无菌条件下，剪取0.5～1cm长的丛生芽茎尖浸泡于0.3～0.5g·L?1的秋水仙素溶液中，黑暗条件下振荡24～72h；4）恢复培养：在无菌条件下，将秋水仙素处理后的丛生芽茎尖用无菌水洗干净，接种于愈伤组织培养基中培养12～14天后，再接种于丛生芽培养基中培养26～30天，获得多倍体丛生芽；5）增殖培养：将多倍体丛生芽接种到新的丛生芽培养基中进行增殖培养20～25天；??6）多倍体鉴定：取增殖培养后丛生芽的茎尖进行染色体数目观察，在一个根尖上同时观察到5?个以上分裂相染色体数目加倍，即可确证该变异株系为多倍体；7）生根培养：在无菌条件下，将鉴定为多倍体的株系从基部切下，转接到生根培养基中培养8～15天，获得生根苗；8）炼苗：取出生根苗，转接到装有蛭石和砂子的盆中，在室内炼苗培养28～40天；9）移苗：炼苗后，将盆苗移到室外，或者将苗从盆中移栽到田间，遮上有70～85%遮阳率的阴棚，培养8～12天后，移去阴棚，进行田间栽培管理，即可。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李明，梁生旺，杨全，伍彧，
申请(专利权)人：广东药学院，
类型：发明
国别省市：