酶-孔构建体制造技术

本发明专利技术涉及包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶的构建体。所述孔亚基与所述酶共价结合，从而所述亚基与所述酶均保留其活性。所述构建体可用于产生其上结合有核酸操作酶的跨膜蛋白孔。这些孔特别可用于测序核酸。所述酶操作核酸的方式使得所述孔可通过随机传感来检测其组成核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶的构建体。所述孔亚基与所述酶共价结合，从而所述亚基与所述酶均保留其活性。所述构建体可用于产生其上结合有核酸操作酶的跨膜蛋白孔。这些孔特别可用于测序核酸。所述酶操作核酸的方式使得所述孔可通过随机传感来检测其组成核苷酸。【专利说明】酶-孔构建体本申请为分案申请，其原申请的申请日为2009年7月6日，申请号为200980134886.6 (国际申请号为PCT/GB2009/001679)，名称为“酶-孔构建体”。
本专利技术涉及包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶(nucleic acid handlingenzyme)的构建体。所述孔亚基与所述酶共价结合使得所述亚基与所述酶均保留其活性。所述构建体可用于产生结合有核酸操作酶的跨膜蛋白孔。这些孔特别可用于核酸测序。所述酶操作核酸的方式使得所述孔可通过随机传感来检测其每个组成核苷酸。
技术介绍
随机传感是一种依赖于对分析物分子与受体之间个体结合事件的观察结果的传感方法。随机传感器可通过如下方式形成:将纳米尺寸的单孔置入绝缘膜中，并且在存在分析物分子的情况下测量电压驱动的穿过所述孔的离子转运。电流波动的发生频率可揭示在所述孔中结合的分析物的浓度。分析物的种类通过其特征性的电流特征特别是电流阻断的持续时间和程度而示出(Braha, 0., Walker, B., Cheley, S., Kasianowicz, J.J., Song, L., Gouaux, J.E., and Bayley, H.(1997) Chem.Biol.4, 497-505 ; andBayley, H., and Cremer, P.S.(2001)Nature413, 226-230)。形成细菌孔的毒素α-溶血素(α-HL)的基因工程改造形式已用于对许多类型的分子进行随机传感(Bayley, H., and Cremer, P.S.(2001) Nature413, 226-230; Shin, S., H., Luchian, T., Cheley, S., Braha, 0., and Bayley, H.(2002) Angew.Chem.1nt.Ed.41, 3707-3709; Guan, X., Gu, L.-Q., Cheley, S., Braha, 0., and Bayley, H.(2005)ChemBio Chem6，1875-1881)。在这些研究的过程中，已发现，试图将a-HL改造以直接结合小的有机分析物的尝试是很费力的，并且鲜有成功的实例(Guan，X.，Gu, L.-Q.，Cheley, S., Braha, 0., and `Bayley, H.(2005) ChemBio Chem6, 1875-1881)。幸运地是，人们发现了一种不同的策略，该策略利用了非共价结合的分子衔接体，特别是环糊精(Gu，L? -Q., Braha, 0., Conlan, S., Cheley, S., and Bayley, H.(1999) Nature398, 686-690)、环妝(Sanchez-Quesada, J., Ghadiri, M.R., Bayley, Η., and Braha, 0.(2000) J.Am.Chem.Soc.122，11758-11766)和葫芦脲(Braha, 0.，Webb, J.，Gu, L.-Q.，Kim, K.，and Bayley, H.(2005) ChemPhysChem6, 889-892)。环糊精可短暂地进入所述a -HL孔中，并产生很大程度但不完全的通道阻断。有机分析物在环糊精的疏水内部发生结合，它们可加强这种阻断，使得可实现分析物检测(Gu, L.-Q., Braha, 0., Conlan, S., Cheley, S., and Bayley, H.(1999)Nature398, 686-690)。现在在大范围应用中需要快速且廉价的DNA或RNA测序技术。现有的技术速度慢且价格昂贵，这主要是由于其倚赖于扩增技术产生大量核酸并且需要大量专用的荧光化学物质进行信号检测。随机传感有可能通过减少所需核苷酸和试剂的量提供快速且廉价的DNA测序。
技术实现思路
专利技术人出人意料地证明了跨膜蛋白孔亚基与核酸操作酶的共价结合，可产生既能形成孔又能操作核酸的构建体。专利技术人还出人意料地证明了所述构建体可用于产生一种既能操作核酸又能通过随机传感测序核酸的跨膜蛋白孔。所述酶与所述孔的固定性质与紧密接近是指靶核酸中的核苷酸的一部分会与所述孔相互作用并以特征性的方式影响流过所述孔的电流。因此，包含这种构建体的跨膜蛋白孔是用于随机传感特别是用于测序核酸的有用工具。因此，本专利技术提供了一种包含跨膜蛋白孔亚基和核酸操作酶的构建体，其中所述亚基与所述酶共价结合，其中所示亚基保留其形成孔的能力并且其中所述酶保留其操作核酸的能力。本专利技术还提供了:-一种编码本专利技术构建体的核酸序列；-一种用于测序核酸的改性孔，包含至少一种本专利技术构建体；-一种产生用于测序核酸的经改变的孔的试剂盒，包含:(a)至少一种本专利技术构建体；和(b)形成孔所需的任何其他亚基；-一种产生用于测序核酸的经改变的孔的试剂盒，包含:(a)至少一种本专利技术的多核苷酸；和(b)编码形成孔所需的任何其他亚基的多核苷酸序列；-一种产生本专利技术构建体的`方法,包括:(a)使核酸操作酶与跨膜蛋白孔亚基共价结合；和(b)确定所得构建体是否能够形成孔和操作核酸；-一种产生本专利技术的经改变的孔的方法，包括:(a)使核酸操作酶与跨膜蛋白孔共价结合；和(b)确定所得孔是否能够操作核酸并检测核酸；-一种产生本专利技术的经改变的孔的方法，包括:(a)使至少一种本专利技术构建体与其他合适的亚基形成孔；和(b)确定所得孔是否能够操作核酸并检测核苷酸；-一种纯化包含至少一种本专利技术构建体的跨膜孔的方法，包括:(a)提供所述至少一种构建体与形成孔所需的其他亚基；(b)使所述至少一种构建体与其他亚基在合成脂质囊泡上寡聚体化；和(C)使所述囊泡与非离子表面活性剂接触；和(d)回收所述寡聚体化的孔；-一种测序靶核酸序列的方法，包括:(a)使所述靶序列与本专利技术的孔一其包含核酸外切酶一接触，从而使所述核酸外切酶从所述靶序列的一端消化单个核苷酸；(b)使所述核苷酸与所述孔接触从而使所述核苷酸与所述衔接体相互作用；(C)测量在相互作用过程中通过所述孔的电流并且从而确定所述核苷酸的种类；和(d)在靶序列的同一端重复步骤(a)到(C)从而确定所述靶序列的序列；以及-一种测序靶核酸序列的方法，包括:(a)使所述靶序列与本专利技术的孔接触从而使所述酶将所述靶序列推过或拉过所述孔，所述靶序列中核苷酸的一部分与所述孔相互作用；和(b)测量在每个相互作用过程中通过所述孔的电流并且从而确定所述靶序列的序列。【专利附图】【附图说明】图1示出了核酸外切酶如何催化磷酸二酯键的水解。在所述核酸外切酶的活性位点内，水分子能够与多核苷酸(DNA)的3’末端的磷酸基反应。磷酸基与糖之间的键向5’端的断裂可释放出单磷酸(脱氧)核苷。图2示出了实施例中所用的核酸外切酶的晶体结构，对每种核酸外切酶均示出了N和C末端及活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测核苷酸向核酸链的添加的方法，包括(a)在存在孔的情况下，使所述核酸链与(i)聚合酶和(ii)经标记的核苷酸接触，从而使得当核苷酸添加至所述核酸链时，磷酸标记物质依次释放，其中所述磷酸物质含有对每种核苷酸特异的标记物；和(b)使用所述孔检测所述磷酸标记物质，并从而检测所述核苷酸向所述核酸链的添加。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：L·贾娅辛格，H·贝利，S·切里，B·麦基翁，J·怀特，J·克拉克，
申请(专利权)人：牛津纳米孔技术有限公司，
类型：发明
国别省市：