本发明专利技术公开了检测空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素耐药突变位点的方法。该方法包括:以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲菌作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析；根据高分辨率熔解曲线的比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T：如待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的一致，待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与突变型标准菌株的一致，待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)又称空肠弯曲杆菌,是引起人急性胃肠炎的最重要的食源性致病菌之一，临床上95%以上的弯曲菌性肠炎都是由空肠弯曲菌和结肠弯曲菌引起。空肠弯曲菌可通过食物链传播给人，污染的禽肉、牛奶和饮用水都是主要的传播途径。喹诺酮类药物是治疗空肠弯曲菌引起的肠炎中使用最普遍的药，同时也是临床上针对弯曲菌感染的一线治疗药物。耐药空肠弯曲菌的出现导致临床上空肠弯曲菌病病程迁延不愈和治疗失败，极大的威胁人类健康，同时耐药菌株也导致治疗成本增加等问题，造成巨大的经济损失。空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素的耐药性是由其DNA促旋酶A亚基的编码基因(gyrA基因)上的喹诺酮耐药决定区(QRDR)的点突变所引起。gyrA的野生型基因如序列表的序列3所示，其读码框(编码序列)为序列3第287至2878位核苷酸所示(2592个核苷酸)。gyrA基因读码框(编码序列)第257位(序列3的第543位)核苷酸由C突变为T (因此又称C257T突变)，造成其编码的蛋白质的第86位氨基酸残基由苏氨酸(由aca编码)突变为异亮氨酸(由ata编码)，引起空肠弯曲菌对喹诺酮类抗生素表现出高水平耐药(最小抑菌浓度均≥64mg/ μ L)。因此，gyrA基因读码框的第257位核苷酸被称为257突变位点，又被称为喹诺酮类抗生素耐药突变位点。为了确定待检空肠弯曲菌是否高水平耐受喹诺酮类抗生素，有必要建立一种快速准确的分子生物学检测方法。目前用于检测空肠弯 曲菌耐药的方法主要有传统的药物敏感性试验法和基因型突变检测法。传统的基因型突变检测法主要有聚合酶链式反应-线性探针法、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法、错配扩增突变聚合酶链反应法及荧光定量聚合酶链式反应法等方法，上述几种以聚合酶链式反应为基础的基因型突变检测方法成本较高，不适宜对大量样品进行检测，而且仅是定性试验，无法进行点突变基因突变方向判定的定性试验。传统的药物敏感性试验需要进行空肠弯曲菌培养，要求较高的培养条件，需要花费大量的时间，不满足急性传染病紧急疫情防治工作的需要。高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting, HRM)是在实时荧光定量PCR基础上通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种新兴技术。高分辨率熔解曲线技术基于有序列变化的基因片段之间微弱的Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种简便、快捷、准确率高、可进行批量检测的检测引起高水平耐受喹诺酮类抗生素空肠弯曲菌点突变的方法。本专利技术所提供的，是一种快速检测由于核苷酸点突变引起对喹诺酮类抗生素耐药的空肠弯曲杆菌gryA突变位点的分子生物学方法，具体是辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法，包括:以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲菌作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析,所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析、所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析和所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线分析中除PCR扩增的模板为各自的基因组DNA外，其它分析条件均相同；将待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线和突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线进行比较，根据比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T:如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株；所述野生型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸与SEQ ID N0.3的第495-625位相同，所述突变型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位为T外，其它与SEQ ID N0.3的第495-625位相同；所述高分辨率熔解曲线分析包括PCR扩增，所述PCR扩增采用的扩增引物满足如下条件:扩增的目的DNA片段长度为100-250bp且包括空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位；所述PCR扩增采用的反应体系中的镁离子浓度为2.0mM。在本专利技术的一个【具体实施方式】中，所述PCR扩增采用的扩增引物是PgyrA131，PgyrAl31由上游引物和下游引 物组成，所述上游引物是SEQ ID N0.1所示的单链DNA，所述下游引物是SEQ ID N0.2所示的单链DNA。在本专利技术的一个具体实施例方式中，所述野生型标准菌株为空肠弯曲菌NCTCl1168株(标准株，获自NCTC，编号为11168)。所述突变型标准菌株为空肠弯曲杆菌ZPl I。上述方法中，所述高分辨率熔解曲线分析中，每20微升PCR反应体系中含有10微升PCR扩增缓冲液，2.0mM镁离子缓冲液，0.4 μ M所述上游引物，0.4 μ M所述下游引物，所述模板lOOpg，其余为水；所述PCR扩增缓冲液、镁离子缓冲液和水均来自LightCycler 480High Resolution Melting Master。所述LightCycler 480 High Resolution Melting Master 为罗氏(Roche)试剂，货号为 04909631001。上述方法中，所述PCR扩增采用的引物退火条件为60°C退火30s。在本专利技术的一个【具体实施方式】中，所述PCR扩增中采用的PCR反应温度程序如下:先95°C预变性IOmin ;然后进行如下30个循环:95°C变性10s，60°C退火30s，72°C延伸10s。在本专利技术的一个【具体实施方式】中，所述高分辨率熔解曲线分析采用罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统(该系统包括罗氏480荧光定量PCR仪器和罗氏的基因扫描程序模块)。上述方法中涉及的辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的引物PgyrA131也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了可利用高分辨率熔解曲线分析技术辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的成套产品。本专利技术所提供的辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的成套产品，包括扩增引物、LightCycler480High Resolution Melting Master和罗氏LightCycler480实时荧光定量PCR系统；所述扩增引物满足如下条件:扩增的目的DNA片段长度为100-250bp且包括空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位。上述成套产品中，所述扩增引物具体可为上述PgyrA131。本专利技术的方法能快速、大批量(如采用384孔PCR反应板，可以同时检查一百多个待测空肠弯曲菌)确定待检空肠弯曲菌是否耐受喹诺酮类抗生素，从而简化了以药敏试验为代表的传统检测方法的复杂程序，具有良好的特异性和灵敏度，比其他检测方本文档来自技高网...
【技术保护点】
辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法，包括:以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲菌作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析，所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析、所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析和所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线分析中除PCR扩增的模板为各自的基因组DNA外，其它分析条件均相同；将待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线和突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线进行比较，根据比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T：如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株；所述野生型标准菌株的gyrA基因的第495‑625位核苷酸与SEQ ID No.3的第495‑625位相同，所述突变型标准菌株的gyrA基因的第495‑625位核苷酸除第543位为T外，其它与SEQ ID No.3的第495‑625位相同；所述高分辨率熔解曲线分析包括PCR扩增，所述PCR扩增采用的扩增引物满足如下条件：扩增的目的DNA片段长度为100‑250bp且包括空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位；所述PCR扩增采用的反应体系中的镁离子浓度为2.0mM。...
【技术特征摘要】
1.辅助检测或检测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T的方法，包括: 以gyrA基因编码序列的第257位是C的空肠弯曲菌作为野生型标准菌株，以gyrA基因编码序列的第257位是T的空肠弯曲菌作为突变型标准菌株，与待测空肠弯曲菌分别同时进行高分辨率熔解曲线分析，所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析、所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线分析和所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线分析中除PCR扩增的模板为各自的基因组DNA外，其它分析条件均相同；将待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线和突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线进行比较，根据比较结果确定待测空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位是C还是T:如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述野生型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是C的菌株，如果所述待测空肠弯曲菌的高分辨率熔解曲线与所述突变型标准菌株的高分辨率熔解曲线一致，所述待测空肠弯曲菌候选为gyrA基因编码序列的第257位是T的菌株； 所述野生型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸与SEQ ID N0.3的第495-625位相同，所述突变型标准菌株的gyrA基因的第495-625位核苷酸除第543位为T外，其它与SEQ ID N0.3的第495-625位相同； 所述高分辨率熔解曲线分析包括PCR扩增，所述PCR扩增采用的扩增引物满足如下条件:扩增的目的DNA片段长度为100-250bp且包括空肠弯曲菌gyrA基因编码序列的第257位；所述PCR扩增采用的反应体系中的镁离子浓度为2.0mM。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增采用的扩增引物是PgyrA131, PgyrAl31由上游引物和下游引物组成，所述上游...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴聪明，汪洋，吴辰斌，沈建忠，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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