本发明专利技术公开了一种有机磷农药快速检测用生物传感器及其检测方法，以饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，以固定有酪氨酸酶和1,2-萘醌-4-磺酸钠底物的玻碳电极上作为工作电极，该工作电极用非导电聚合物将酪氨酸酶和1,2-萘醌-4-磺酸钠底物一起电化学聚合固定在玻碳电极上，因此利用本发明专利技术的生物传感器检测有机磷农药更可靠、灵敏、快速。本发明专利技术的生物传感器制备简单，可重复使用，利用率高，适合现场操作，利用这种生物传感器检测有机磷农药，不用每次都配置酶和底物溶液，能在较短的时间内筛选出大量的超标样品，缩小定量检测范围，是复杂的实验室方法的有效补充。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，以饱和甘汞电极为参比电极，铂片电极为对电极，以固定有酪氨酸酶和1,2-萘醌-4-磺酸钠底物的玻碳电极上作为工作电极，该工作电极用非导电聚合物将酪氨酸酶和1,2-萘醌-4-磺酸钠底物一起电化学聚合固定在玻碳电极上，因此利用本专利技术的生物传感器检测有机磷农药更可靠、灵敏、快速。本专利技术的生物传感器制备简单，可重复使用，利用率高，适合现场操作，利用这种生物传感器检测有机磷农药，不用每次都配置酶和底物溶液，能在较短的时间内筛选出大量的超标样品，缩小定量检测范围，是复杂的实验室方法的有效补充。【专利说明】
:本专利技术涉及食品以及农业领域，具体涉及。
技术介绍
:随着农业产业化的发展，农副产品的生产越来越依赖于农药、激素和抗生素等外源物质。我国农药在粮食、水果、蔬菜、茶叶上的用量居高不下，而这些物质的不合理使用必将导致农副产品中的农药残留超标，影响消费者的食用安全。近年来，由于食品安全引发的问题使得人类健康受到严重的威胁，例如由于过量使用或不符合规定的使用农药而导致水果蔬菜等中农药残留，使人们急性或慢性中毒。目前，我国常用的有机磷、氨基甲酸酯类农药如马拉硫磷、甲胺磷、乐果、对硫磷等几十种高毒农药占总农药用量的70%以上。这些有机磷、氨基甲酸酯类农药都是通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性使组织中乙酰胆碱不能分解而过量蓄积，使一系列以乙酰胆碱为传导介质的神经处于过度兴奋，最后衰竭而引起轻重不等的中毒。且它们易溶于有机溶剂，在中性和酸性条件下稳定，不易水解，在碱性条件下易水解而失效。因此，对食品中农药残留量的快速检测一直是食品安全检测的重要课题。控制农产品中农药残留量的关键环节之一就是对农产品中农药残留量及时、准确的分析检测，以监控农药的合理使用，同时杜绝农药残留超标的产品上市销售。对食品中农药残留量的检测，传统采用GC/MS等农药残留分析技术，但这些技术存在检测成本高、时间长的弊端，这给食品安全监管部门对农产品产前、产中、产后的监督工作带来了许多不便，因此大量的快速检测技术孕育而生。利用有机磷农药和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的特异性抑制反应而发展的乙酰胆碱酯酶快速分析方法已广泛应用于痕量和微量有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留检测，然而，乙酰胆碱酯酶常会被农残物不可逆性抑制，重复使用时需要对酶进行激活，而常常遇到酶不能重新激活的情况，因而该方法实际应用因重复性和灵敏度问题受到一定的限制。因而各国科学家都在致力于寻找新的、性能更好的酶代替目前的乙酰胆碱酯酶，已有采用一些新的酶(如酪氨酸酶、维生素C氧化酶、葡萄糖氧化酶、碱性和酸性磷酸酯酶、有机磷水解酶)制成生物传感器应用到农药残留快速检测方面的研究报道，比如曲云鹤等(参见文献:曲云鹤，肖飞，程欲晓，施国跃，金利通.Tyr/Glu/Fe304/Nafion/CNT/GCE酪氨酸酶生物传感器的制备及应用于农药检测的研究.化学学报，2010，68 (6):535-539.)公开了一种酪氨酸酶生物传感器的制备及应用于农药检测，用酪氨酸酶制备的生物传感器的重复性好，灵敏度高，可以重复使用，能满足痕量有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留检测的要求。但将酶固定在电极上的生物传感器，每次检测时需要配 置底物溶液，不利于现场快速的初筛工作。
技术实现思路
:本专利技术的目的是提供。本专利技术是通过以下技术方案予以实现的:—种固定有酪氨酸酶和1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)底物的玻碳电极的制备方法，该方法包括以下步骤:a、将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨光亮，清洗干净后晾干；b、将新配置的10 U L0.05mol/L的1，2_萘醌_4_磺酸钠(NQS)溶液滴涂在在步骤a得到的裸玻碳电极表面，自然晾干；C、将10 u L20mg/mL的酪氨酸酶和5 u L2.5mg/mL的戍二醒溶液一起滴涂在经步骤b处理过的玻碳电极上，在4°C通氮气下晾干，得到经滴涂处理的玻碳电极；d、将非导电聚合物单体溶于0.05mol/L PH=6.5的磷酸缓冲液中得到浓度为0.05mol/L的非导电聚合物单体溶液，通N2除氧，然后将步骤c得到的经滴涂处理的玻碳电极泡在0.05mol/L的非导电聚合物单体溶液中经电化学方法聚合得到表面上覆盖有一层非导电聚合物薄膜的玻碳电极，将制作好的目标电极贮存在4°C的磷酸缓冲液中24h以上再使用。 所述非导电聚合物单体优选为间苯二胺，所述非导电聚合物优选为聚间苯二胺。聚合前非导电聚合物单体溶液通N2除氧可以防止聚合反应初期氧气对自由基阳离子的进攻。所述电化学方法聚 合是在0.8V电压下作用30s。本专利技术还提供一种有机磷农药快速检测用生物传感器，该传感器以饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，钼片电极为对电极，以上述固定有酪氨酸酶(Tyr)和底物1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)的玻碳电极作为工作电极。该工作电极用非导电聚合物将酪氨酸酶(Tyr)和底物(NQS)—起经电化学聚合固定在玻碳电极上。所述非导电聚合物优选为聚间苯二胺。所述有机磷农药选自灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷中的任一种。一种有机磷农药快速检测方法，该方法将前述有机磷农药快速检测用生物传感器放入PH=6.5的磷酸缓冲液溶液中，利用计时电流法在电化学工作站上用电流-时间方法扫描，研究酪氨酸酶玻碳电极的电化学行为，包括以下步骤:首先在未加有机磷农药之前测定空白曲线，是在30mL0.05mol/L的磷酸缓冲液(通0215min)中进行扫描，在E=+0.1OV下稳定90s ;在￡=-0.15V下作用15s ;在￡=+0.1OV下恢复60s ；空白曲线测定好之后，加入5 U L的配置好的有机磷农药溶液，孵育Imin后进行测定，按上述步骤进行，记录不同浓度有机磷农药对酪氨酸酶抑制的曲线。所述有机磷农药快速检测用生物传感器的作用机理如下:被固定在工作电极上的酪氨酸酶的活性随着脉冲电流的不同而不同。首先吸附在工作电极电极上的是1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)，随着脉冲电流(+0.10V)加载在工作电极上，在没有酶的催化作用使1，2-萘醌-4-磺酸钠(NQS)转化为1，2-萘二酚-4-磺酸钠(H2NQS) ,H2NQS为酶的有效底物。在脉冲电流(-0.150V)加载在工作电极上时，将H2NQS转化为NQS，这就终止了此酶促反应。此时酪氨酸酶也由变位态酪氨酸酶(met-Tyr)转化为脱氧态酪氨酸酶(deoxy-Tyr)，在氧气的作用下脱氧态酪氨酸酶(deoxy-Tyr)转化为氧化态的酪氨酸酶(oxy-Tyr) ,H2NQS同时也与氧化态酪氨酸酶(oxy-Tyr)作用自身氧化成NQS的同时，将酪氨酸酶还原成变位态(met-Tyr)。这样就完成了一个循环，NQS和Tyr都能循环的使用。具体反应的机理如下:NQS2H+2eH2NQS (E=+0.1V)H2NQSmet-Tyr -2e_NQS+deoxy-Tyr +2H+02+deoxy-Tyr oxy-Tyr 所述有机磷农药选自表I所示的序号为I?5、8?9、11?15、17?26有机磷农药，优选为灭菌磷、碘硫磷、二嗪磷、甲基氯吡硫磷等有机磷农药。本专利技术具有如下有益效果:(I)本专利技术利用非导电聚合物自身抑制生长的特点在电化学聚合时得到的膜的厚度在IO-1OOnm,本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种固定有酪氨酸酶和1,2‑萘醌‑4‑磺酸钠底物的玻碳电极的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：a、将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨光亮，清洗干净后晾干；b、将新配置的10μL0.05mol/L的1,2‑萘醌‑4‑磺酸钠溶液滴涂在步骤a得到的裸玻碳电极表面，自然晾干；c、将10μL20mg/mL的酪氨酸酶和5μL2.5mg/mL的戊二醛溶液一起滴涂在经步骤b处理过的玻碳电极上，在4℃通氮气下晾干，得到经滴涂处理的玻碳电极；d、将非导电聚合物单体溶于0.05mol/L PH=6.5的磷酸缓冲液中得到浓度为0.05mol/L的非导电聚合物单体溶液，通N2除氧，然后将步骤c得到的经滴涂处理的玻碳电极泡在0.05mol/L的非导电聚合物单体溶液中经电化学方法聚合得到表面上覆盖有一层非导电聚合物薄膜的玻碳电极，将制作好的目标电极贮存在4℃的磷酸缓冲液中24h以上再使用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：潘文龙，柳亚玲，陈泳，杜志云，李正全，朱黎明，韦文蔚，叶汝汉，仇镇武，林晨，尹冲，
申请(专利权)人：中国广州分析测试中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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