三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用。具体地，提供了具有靶向肿瘤、促进穿膜和核定位三重功能的多肽，该多肽与两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺偶联形成的基因载体及其制备方法，该基因载体与DNA形成的复合物，以及上述具备三重功能的多肽和基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。本发明专利技术的基因载体体内转染效率高、细胞毒性低、靶向性强，具有广阔的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用。具体地，提供了具有靶向肿瘤、促进穿膜和核定位三重功能的多肽，该多肽与两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺偶联形成的基因载体及其制备方法，该基因载体与DNA形成的复合物，以及上述具备三重功能的多肽和基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。本专利技术的基因载体体内转染效率高、细胞毒性低、靶向性强，具有广阔的临床应用前景。【专利说明】三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用
本专利技术涉及基因工程和分子生物学
，具体地说，涉及一种三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用。
技术介绍
基因治疗是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理基础上的新型治疗方法，因肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变，所以基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望，也是研究最活跃的领域。 基因治疗有三个重要环节，即目的基因、转基因载体和靶细胞。基因导入系统是基因治疗的核心技术。现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体。目前应用的载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率较高但存在运载能力低、有潜在安全威胁等问题，因此，非病毒载体近年来发展迅速，尤其是阳离子聚合物。聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，富含阳离子，具有强大的缓冲能力，有较强结合DNA和黏附细胞的能力。然而，PEI作为基因载体使用存在两个突出问题。第一，转染效率与细胞毒性存在矛盾:小分子PEI虽细胞毒性低，但在生理的离子浓度下与DNA易发生解离，造成转染效果差；分子量在20kDa以上的PEI虽具有较理想转染效率，但由于PEI的表面富含阳性电荷以及体内不可降解性，致使高分子量PEI表现出较强的细胞毒性。第二，PEI靶向性差:它是利用自身所带的正电荷，与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合，所以细胞的选择特异性差，解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。因此，如何将PEI改造成转染效率高、细胞毒性低、靶向性强的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破口。为解决PEI作为基因载体使用中存在的问题，2010年本课题组申请并获得了项目名称为“壳聚糖季铵盐连接低分子量聚乙烯亚胺作为骨架的靶向DNA纳米复合物的构建及其抗肿瘤作用研究”的国家自然科学基金资助，并就研究成果申请了专利，参见申请号CN201110372497.6，【公开日】2012.06.27。两亲性壳聚糖N-辛基-N-季铵化壳聚糖(OTMCS)无毒、无刺激、无免疫原性，通过化学交联的方法连接PEI，尤其低分子量PEI (如PEI 600/800/2000),以形成多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，该衍生物可保证较高转染效率，转染进入体内细胞后，这些交联的化学键又可以通过水解等反应断开，高分子量PEI衍生物断裂成易代谢的低分子量低毒性的PEI，这就使得其在保证一定转染效率的前提下，大大降低了高分子PEI所带来的细胞毒性；另一方面，OTMCS同时具有亲水链和疏水链，在水中可自发形成多分子球形胶束样结构，该胶束可显著提高复合物在体液中的稳定性，且尺寸可达纳米级，因此适宜基因药物在体内的传输。专利技术人还提交过专利申请CN201110372844.5，【公开日】2012.04.04，该研究是将普朗尼克P123连接PEI，得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物P123-PEI，选择特异亲和整合素a 3的RGD短肽，与细胞穿膜肽Tat (49-57)连接，合成具有靶向于av^3 3和促进载体穿膜的双功能肽，再利用交联技术将R13与PEI衍生物偶联，构建新型非病毒基因载体系统，并检验了该系统的细胞毒性和体外转染效率。然而，上述两种非病毒基因载体系统虽然表现出体液稳定性增强、细胞毒性明显降低、体外转染效率及肿瘤靶向能力提高等一系列优点，但其体内转染效率较体外明显偏低，这也是目前非病毒基因载体研究中普遍存在的共性问题。究其原因，可能涉及以下两个方面:其一是体内环境复杂，复合物入体内后要面临免疫系统及生理屏障等诸多因素干扰；其二是体内外转染跨越细胞核膜的方式不同，其中后者更为关键。复合物细胞内解离机理的研究表明，细胞中RNA导致其目的基因的释放，因RNA在细胞中主要分布在细胞核，所以聚合物/DNA复合物也是需要进入到细胞核中，并被RNA解离从而发挥作用的。因此，如何提高阳离子复合物在体内靶细胞的核递送成为其能否应用于临床的关键之一。核定位信号肽NLS是核内功能蛋白进入细胞核的结构基础，是介导某些蛋白入核的一段充分而必要的信息片段，大分子物质可通过NLS的介导经核孔复合物主动运转至细胞核内，其中研究最多的NLS是来自SV40的T抗原,主要功能序列为Lys-Lys-Lys-Arg-Lys(KKKRK)0因此，理论上可将R⑶短肽、细胞穿膜肽Tat (49-57)、NLS (KKKRK)连接，合成具有靶向于a V P 3、促进载体穿膜、入核的含RGD和Tat (49-57) ,NLS (KKKRK)的三功能多肽，用于修饰0TMCS-PEI衍生物，提高其肿瘤细胞选择性，又可促进载体穿膜，并提高核递送能力，从而增加DNA的体内转染效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种多肽。本专利技术的再一的目的是，提供一种基因载体。 本专利技术的另一的目的是，提供上述基因载体的制备方法。本专利技术的第四个目的是，提供一种复合物。本专利技术的第五个目的是，提供上述多肽及基因载体的用途。为实现上述第一个目的，本专利技术采取的技术方案是: 一种多肽，所述的多肽的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys0为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是: 一种基因载体，所述的基因载体包含两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺与如上所述的多肽所形成的偶联物，所述的两亲性壳聚糖的分子量为l_20KDa，所述的聚乙烯亚胺的分子量为0.6-70KDa，所述的两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:20。优选地，所述的两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:10。更优选地，所述的两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:10。优选地，所述的两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺与多肽的摩尔比为1:1-1:15。更优选地，所述的两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺与多肽的摩尔比为1:2-1:10。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是: 如上任一所述的基因载体的制备方法，包括以下步骤: (a)合成如上所述的多肽； (b)于两亲性壳聚糖中加入三光气，溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的溶剂中反应过夜，除去溶剂后再用适量溶剂溶解，加入N-羟基琥珀酰亚胺活化，将活化后的两亲性壳聚糖用二氯甲烷溶解，与无水乙醇溶解的聚乙烯亚胺混合，搅拌，偶联得到两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺； (C)马来酰亚胺化步骤(b)制备的两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺，再加入步骤(a)合成的多肽，搅拌，偶联。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是: 如上任一所述的基因载体与DNA形成的复合物。所述的DNA可以含报告基因、抗癌基因和/或细胞因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为：Arg‑Gly‑Asp‑Arg‑Lys‑Lys‑Arg‑Arg‑Gln‑Arg‑Arg‑Arg‑Lys‑Lys‑Lys‑Arg‑Lys。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘克海，朱曼曼，吕慧，赵文芳，毛媛，胡静，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31