一种提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制备方法技术

本发明专利技术涉及一种提高M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制备方法，具体的说，针对PKM2蛋白的特性，在蛋白表达时设计两种不同形式的片段：A片段用于免疫，通过标签GST连接PKM2特异序列多肽抗原，不但可提高蛋白的表达量，而且易于纯化，明显提高免疫效果；B片段群用于筛选，包括PKM2的9个独特的氨基酸序列，减少非特异性抗体，提高筛选效率，可以用于筛选不同表位的抗体。通过这些不同特点的抗原，一方面提高蛋白的表达纯化及免疫效果，另一方面用于筛选特异的高亲和力抗体，提高单克隆抗体的制备效率。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种提高M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制备方法，具体的说，针对PKM2蛋白的特性，在蛋白表达时设计两种不同形式的片段：A片段用于免疫，通过标签GST连接PKM2特异序列多肽抗原，不但可提高蛋白的表达量，而且易于纯化，明显提高免疫效果；B片段群用于筛选，包括PKM2的9个独特的氨基酸序列，减少非特异性抗体，提高筛选效率，可以用于筛选不同表位的抗体。通过这些不同特点的抗原，一方面提高蛋白的表达纯化及免疫效果，另一方面用于筛选特异的高亲和力抗体，提高单克隆抗体的制备效率。【专利说明】一种提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制备方法
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制备及抗体筛选的方法。
技术介绍
近年来肿瘤生物学技术的进展，发现许多新型的肿瘤诊断生物标志物。M2型丙酮酸脱氢酶激酶(PKM2)是目前肿瘤研究领域最为热门的一个肿瘤生物标志物，它作为肿瘤细胞糖酵解代谢通路的关键酶，与肿瘤发生发展密切相关。它在正常组织中仅表达于肌肉和快速增生组织，在肿瘤组织显著高表达，是许多肿瘤细胞共性的特征。丙酮酸激酶有四种亚型:PKM1、PKM2、PKL及PKR。PKMl主要表达于分化成熟的组织如肌肉和神经组织，PKM2主要表达于快速增生的细胞，如胚胎干细胞、正常快速增生细胞及肿瘤细胞等，PKL主要表达于肝脏、肾脏及结肠，PKR表达于红细胞中。结肠癌中PKM2的高表达，常随着肿瘤细胞的脱落，可在粪便中被检测到，因此可作为结肠癌的诊断生物标志物。以往对结肠癌的筛查和诊断，常通过粪便中的隐血试验，然而隐血试验由于取样的误差及饮食因素影响等，常导致较高的假阳性率和假阴性率。近几年的临床研究发现，粪便中的PKM2检测可显著提高结肠癌的诊断准确率，灵敏度达80 %，特异性达92%，因此将成为今后结肠癌的筛查和诊断的重要生物标志物。血液中PKM2的表达增加，提示有肿瘤的发生，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌等。此外，尿液中的PKM2增加，提示患有肾癌，这是第一个有希望作为肾癌的肿瘤生物标志物。综上所述，PKM2是一个重要的肿瘤生物标志物，粪便中的PKM2检测可帮助诊断结肠癌等胃肠道肿瘤，尿液中PKM2的检测可辅助诊断肾癌，血液中PKM2的检测可辅助诊断乳腺癌及肺癌等。目前PKM2的检测试剂盒仅德国的ScheB0.Biotech AG公司有生产相关诊断产品，主要有用于结肠癌筛选的检测试剂盒及血清中PKM2的检测试剂盒，其产品“免疫层析法快速检测试剂盒”能在数分钟内检测粪便中的PKM2含量，现已用于各医院的临床检测。此产品由于价格比较昂贵，若进口到国内在医院中使用，其昂贵的价格普通病人难以承受，因此也不便在人群中推广。`其它如Abcam等科研试剂公司提供的PKM2抗体，仅限于科研使用，价格昂贵，且无亲和力、特异性和灵敏度较高的抗体用于临床检测。因此，我国必须开发具有自主知识产权的PKM2检测试剂盒，降低试剂盒的成本，以便能在国内进行推广和普及，使结肠癌等肿瘤能够早期发现早期治疗，提高肿瘤治疗的有效率，能够服务于人民群众的健康事业。目前，PKM2的检测试剂盒的开发主要有两种方法:一是常用的酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒，二是基于免疫层析法的快速检测试剂盒。其相关产品均可用于临床的检测。因此，本申请的研究也开发两种诊断试剂盒，分别为常规的酶联免疫法检测试剂盒和胶体金免疫层析法的快速检测试剂盒。两种类型的检测试剂盒，从价格和便利性方面满足临床上不同的实际需求。由于PKM2仅在氨基酸序列的389-433位与PKMl存在差异(见说明书附图2)，因此需取这部分氨基酸进行作为抗原。而这特异的45个氨基酸序列，由于其片段较小，因此免疫原性较差。本申请的研究策略是将45个氨基酸的抗原序列连接在带有GST标签的pET24a载体上，促进蛋白的正确折叠，提供蛋白的得率及纯化，同时有利于提高抗体的免疫原性，并且可作为初步的抗体筛选所用。在抗体的筛选阶段，合成不同表位的肽段，用于筛选特异性和亲和力高的抗体，用于后续的试剂盒开发。这样的一种针对M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制备方法，即克服了蛋白免疫原性差的弱点，也有利于目的蛋白的获取和后续抗体的筛选，因此鉴于以上的技术背景，提出本专利技术方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种能简便、高效地进行PKM2蛋白在原核系统中的制备工艺。该专利技术使得PKM2蛋白的免疫原性增强，增加了抗PKM2蛋白抗体的多样性。该专利技术简单易行，适用于低分子量蛋白的表达、纯化和抗体制备。同时，本专利技术合成PKM2的多种独特的多肽序列，用于高特异性和高亲和力抗体的筛选，减少非特异性抗体，提高抗体的筛选效率。本专利技术的内容主要由两部分组成:1.构建pET24a-GST-PKM2_A的重组蛋白，用于动物的抗原免疫。本申请使用的pET24a载体，已经构建有带有GST的标签。PKM2-A片段的序列为:IYHLQLFEELRRLAPITSDPTEATAVGAVEASFKCCS GAIIVLTK。特异序列见说明书附图1。2.合成PKM2的表位筛选多肽组，序列分别为:l)Biotin-1YHLQLFEEL，2)Biotin-RRLAPITSDP,3)Biotin-TE ATAVGAVE,4)Biotin-ASFKCCSG,5)Biotin-AIIVLTK,6)Biotin-LFEELRRLAP,7)Biotin-1TSDPTEATA,8)Biotin-VGAVEASFKC,9)Biotin-CSGAIIVLTK。【具体实施方式】运用基因克隆的方法构建原核重组表达质粒，纯化蛋白，制备抗体，同时合成筛选多肽，进行单抗筛选。1:pET24a-G ST-PKM2-A重组蛋白的构建及蛋白表达纯化1.1原核表达载体pET24a—GST-PKM2-A的构建1.1.1PCR扩增:PKM2-A基因的PCR扩增，以人结肠癌细胞株HCT116cDNA为模板，进行PCR扩增。总反应体系为80ul，其中含有模板8ul，IOXPCR buffer (Mg+) 8.0 μ 1，2mM dNTP8.Ομ?，正向引物 4.Ομ? (250uM)，反向引物 4.0 μ I (250uM)，Ex-Taq DNA 聚合酶0.8μ 1，补水至80ul。反应条件:预变性94°C 5min ;变性94°C 50sec，退火56°C 50sec，复性延伸72°C Imin ;变性一复性延伸循环30次；延伸72°C IOmin0 PCR产物经电泳验证后用PCR、酶切产物回收纯化试剂盒回收纯化，测其浓度。1.1.2酶切和连接:回收纯化了的PKM2-A基因和质粒pET24a各取约800ng，分别用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切。反应总体系30ul，其中含有模板20ul，BamH Ilul, Xho I I μ I, IOXbuffer 3 μ I,补去离子水 30ul ;于 0.5mlEppendorf 管中，37°C水浴3小时。酶切后的PKM2-A基因和质粒pET24a，用PCR、酶切产物回收纯化试剂盒回收纯化；纯化后的目的基因片段和载体酶切片段，测定260nm处吸光度值(0D260值)，计算片段和载本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白的制备方法，其特征在于：(1)通过GST标签连接PKM2特异序列多肽抗原，提高免疫效果。(2)多种PKM2的多肽序列，偶联至生物素，减少非特异性抗体结合，提高筛选效率。(3)9个多肽中独特的氨基酸序列，可以用于筛选不同表位的抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邹国源，陈琍，高文霞，
申请(专利权)人：上海铂嵋生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：