一株阿法特菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一株阿法特菌及其应用，阿法特菌命名为阿法特菌BC-S336，其保藏编号为CCTCC?NO：M2013121。该阿法特菌BC-S336具有拮抗R.solani?AG-4生长的效果。将阿法特菌BC-S336菌株在PDB培养液中培养6天后的培养液所产生的抗生物质对R.solani?AG-4生长的抑制效果最佳，随后其抑制R.solani?AG-4生长的效果随培养天数的增加明显下降。本发明专利技术的阿法特菌可用于防治白菜立枯病。特别是用于防治白菜苗期立枯病。

【技术实现步骤摘要】
一株阿法特菌及其应用
本专利技术涉及微生物，尤其涉及一株阿法特菌及其应用。
技术介绍
由于人类过度使用系统性杀菌剂，已有很多植物病原真菌产生抗药性，导致植物病害更加难以防治。此外，有些重要的植物病害，如萎凋病、炭疽病、小麦全蚀病和其他的根部病害，目前仍无法被化学药剂有效控制。2009年,杀菌剂抗性作用委员会(FungicideResistance Action Committee, FRAC)将枯草杆菌(Bacillus subtilis strain QST713)列入低风险之药剂名单中，除显示生物制剂备受重视外，同时亦暗示生物农药在使用上仍有令菌株产生抗药性的风险。因此，为了降低抗药性的产生与增进病害之防治成效，研制安全有效、对环境低污染且低毒性的新型生物药剂，在粮食生产上之重要性与日俱增。在生物农药的众多來源中，由阿法特菌产生的抑菌物质，其结构与种类均具有高度多样性，且由于其缺乏与其他农药产生交互抗性，因而较有可能具有新的抑菌作用机制。目前來自阿法特菌并商业化的药剂如嘉赐霉素、保粒霉素、维利霉素等，已普遍应用于多种重要植物病害的防治。阿法特菌具有多重生物防治机制，包括产生各种物质分解酵素与抗生物质、竞争作用、超寄生作用及诱导植物产生抗病性等。有鉴于植物病原真菌对化学农药产生抗药性的问题日益严重，故研制出有效低风险的生物制剂实为当务之急。在作物苗期病害中，立枯病(Rhizoctonia solani Kiihn)引起为常見且难以防治之重要土传性病害之一。2002年，Sabaratnam与Traquair发現施用Streptomyces sp.Di_944防治蕃爺立枯病的成效相当于杀菌剂oxine benzoate,同时他们亦证实了若能选择优良的拮抗菌株,再配合适当的施用方法，其防治效果不亚于化学药剂的施用，且可減少对环境的冲击。因此，本研究之目的在于筛选具有抑制立枯丝核病菌生长的阿法特菌菌株，然后进行不同培养时间的滤液对病原菌抑菌试验，并进行培养滤液的热稳定性测试，最后温室评估防治白菜立枯病的成效。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株阿法特菌(Streptomyces sp.)BC-S336,该菌已于2013年4月3日保存于中国典型培养物保藏中心，地址:中国.武汉.武汉大学，保存编号为 CCTCC NO:M2013121o本专利技术目的之二是提供阿法特菌的应用。菌株由自台湾不同地区所采集的土让，在室内以腐质酸培养基进行土让稀释分离，再藉由形态学、生理生化测试及分子生物学鉴定，并以这些菌株作为本研究之供试菌源。为防止菌株的变异，将菌株培养于ISP4(International StreptomycetesProject4Medium)培养基，经28°C培养7天后，刮取孢子置于25% (v / v)甘油中，然后置于-80 °C下保存。·为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案:一株阿法特菌，命名为阿法特菌(Streptomyces sp.)BC-S336，其保藏编号为 CCTCCM NO:2013121o所述阿法特菌BC-S336具有拮抗R.solani AG-4生长的效果。将所述阿法特菌BC-S336菌株在PDB培养液中培养6天后的培养液所产生的抗生物质对R.solani AG-4生长的抑制效果最佳，随后其抑制R.solani AG-4生长的效果随培养天数的增加明显下降。上述的阿法特菌用于防治白菜立枯病。上述的阿法特菌用于防治白菜苗期立枯病。自台湾不同地区土让所分离的十株阿法特菌菌株，利用对峙培养法测定它们对白菜立枯病病原菌Rhizoctonia solani AG_4的拮抗作用，得知阿法特菌BC-S336菌株可显著抑制R.solani AG-4的生长。将阿法特菌BC-S336菌株培养在马铃薯葡萄糖培养液六天，其培养滤液抑制R.solani AG-4生长的效果最佳。进一步将该培养滤液以不同温度处理后，其抑菌活性的抑制圈大小仅有6.8~7.0mm,比未处理的对照组(9.8mm)小,但各温度处理间则无明显差异，显然该培养滤液可能含有耐热性抗生物质。在网室进行防治试验时，将稀释10倍与100倍之阿法特菌BC-S336培养滤液加至含有不结球白菜种子的病原菌介质中，得知10倍稀释的培养滤液较对照组可分别提高三凤与坂田交配品种之种子发芽率达25.9%与41.6%;而100倍稀释的培养滤液则较对照组可分别增进三凤与坂田交配品种之种子发芽率达16.6%与25.0%。另评估浇灌稀释10倍与100倍链霉菌BC-S336培养液，对移植于帶有病原菌介质中不结球白菜幼苗的存活率之影响。结果显示处理10倍稀释液后，三凤与坂田交配品种之幼苗存活率分别达94.6与89.3% ;而处理100倍稀释液之三凤与坂田交配品种的幼苗存活率，则分别为99.2%与93.1%。综合上述结果显示阿法特菌BC-S336菌株应用于苗期立枯病的防治具有相当大的潜力。【附图说明】图1显示不同培养时间对阿`法特菌BC-S336菌株生长量、培养液pH变化及对Rhizoctonia solani AG-4之抗菌活性的影响。图2显示不同温度处理阿法特菌BC-S336菌株培养滤液对Rhizoctonia solaniAG-4之抗菌活性的影响。图3显示施用阿法特菌BC-S336菌株培养液对叶用白菜(A:三凤品种；B:坂田交配品种)种子于立枯丝核菌感染土中之发芽率。图4显示施用阿法特菌BC-S336菌株培养液对叶用白菜(A:三凤品种；B:坂田交配品种)七天幼苗于立枯丝核菌感染土中之存活率。【具体实施方式】一、阿法特菌菌株的来源与保存阿法特菌(Streptomyces sp.)菌株为本实验自台湾不同地区所采集的土让，在室内以腐质酸培养基进行土让稀释分离，再藉由形态学、生理生化测试及分子生物学鉴定，并以這些菌株作为本研究之供试菌源。为防止菌株的变异，将菌株培养于ISP4 (International Streptomycetes Pro ject4Medium)培养基，经 28°C培养 7 天后，刮取孢子置于25% (v / v)甘油中，然后置于_80°C下保存。二、R.solani AG-4 感染土之制备将50克马铃薯切丁装入500毫升的三角瓶中，经高温高压(120°C，151b，20分钟)处理后，以消毒过的移植针植入在28°C下PDA培养基上培养2天的R.solani AG-4菌丝块(0.5cm)，然后置于不照光30°C定温箱培养，经一星期后，将长滿菌丝的马铃薯取出秤重，并加入200毫升无菌水，再以果汁机均匀搅碎5分钟，并依重量1:10比例混拌至消毒过的BVBN0.4 (Bas Van Burren，荷兰)泥炭土，待混合均匀后，置于密封的塑胶盒中并放置于室温下，每日定时打开透气，每周均匀混拌一次，经4星期后，作为网室接种源使用。三、不同阿法特菌菌株对R.solani AG_4的拮抗作用由腐质酸培养基分离出十种阿法特菌菌株，分别命名为A35、A102、A200、BC_S336、A337、A377、A454、A462、A463和A464。分别以移植环沾取阿法特菌孢子，涂抹在PDA (potatodextrose agar)培养基平板的一侧,然后在距离2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株阿法特菌(Streptomyces?sp.)，命名为阿法特菌BC?S336，其保藏编号为CCTCC?NO：M2013121。

【技术特征摘要】
1.一株阿法特菌(Sti^ptomyces sp.)，命名为阿法特菌BC-S336，其保藏编号为CCTCCNO:M2013121o2.如权利要求1所述的阿法特菌，其特征在于:所述阿法特菌BC-S336具有拮抗R.so Iani AG-4生长的效果。3.如权利要求2所述的阿法特菌，其特征在于:将所述阿法特菌BC-S33...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡依真，钟文全，钟文鑫，林俊良，林家弘，黄萱如，
申请(专利权)人：拜肯生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：