抗肿瘤多肽及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用。本发明专利技术合成的寡肽由天然氨基酸组成，分子量较小，便于人工合成，易于产业化，且抑瘤作用强，对正常白细胞、红细胞无影响，是一种安全、高效、理想的抗癌药物。我们还合成了AOP-1的三个类似物AOP-2、AOP-3和AOP-4，也具有很强的抗肿瘤作用，可作为抗肿瘤药物，特别是在治疗肝癌和Lewis肺癌方面显示出明显的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】
抗肿瘤多肽及其制备方法和应用
本专利技术属于生物化学的多肽药物
，涉及多肽药物的制备方法，更具体的说是一种抗肿瘤多肽及其制备方法和应用。
技术介绍
人们很早就知道尿的药用价值。1943年，Magnelin等首次将尿的提取物用来治疗癌症。1967年Burzynski等从人尿中分离得到了抗瘤酮。目前国外已对抗瘤酮A2、A3>~和仏^进行了 I期和II期临床试验，试验结果表明大部分可以完全缓解，少部分缓解，部分稳定，极少恶化。我们采用适合我国国情的分离纯化方法，从健康男性尿液中分离得到了抗瘤肽，它主要是由Glu、Gly、Leu、Pro、Tyr等氨基酸组成,其分子量小于1000,有明显的抗肿瘤作用。在人尿抗瘤肽的基础上，我们发现并合成了一定结构的化合物，具有很强的抑瘤作用。从而完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的内容如下: 一种抗肿瘤寡肽，其特征在于，所述抗肿瘤寡肽具有SEQ ID NO: 1-4所述的氨基酸序列。其 SEQ ID NO: 1-4 序列为 Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala，X 为 Leu 或 He，Y 为 Thr或 Ser0当X 为 Leu, Y 为 Thr 时，序列为 Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala,所述抗肿瘤寡肽的分子量为846.9。当X 为 lie, Y 为 Thr 时,序列为 Tyr-1le-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala,所述抗肿瘤寡肽的分子量为846.9。当X 为 Leu, Y 为 Ser 时，序列为 Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala,所述抗肿瘤寡肽的分子量为832.88。当X 为 lie, Y 为 Ser 时,序列为 Tyr-1le-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala,所述抗肿瘤寡肽的分子量为832.88。本专利技术同时也公开了抗肿瘤寡肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。其中的肿瘤指的是:肝癌和Lewis肺癌。本专利技术更加详细的内容如下: 本专利技术的目的是用人工合成的方法合成了具有很强抑瘤作用的寡肽(antitumoroligopeptide,简称 Α0Ρ),为八妝，其序列为 Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala(X 为 Leu 或He，Y 为 Thr 或 Ser)。抗肿瘤寡妝-1(A0P-1)序列为 Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala ; 抗肿瘤寡妝 _2 (A0P-2)序列为 Tyr-1le-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala ; 抗肿瘤寡妝 _3 (A0P-3)序列为 Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala ; 抗肿瘤寡妝 _4(A0P-4)序列为 Tyr-1le-Glu-Pro-Gly-Pro-Ser-Ala。体外及体内试验表明A0P-1、A0P-2、A0P-3、A0P-4均具有很明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，可用来制备抗肿瘤药物，用于治疗肿瘤。特别是肝癌和Lewis肺癌的药理实验显示具有明显的治疗作用。本专利技术进一步公开了抗肿瘤寡肽的制备方法，其特征在于采用液相合成法或固相合成法合成抗肿瘤寡肽。本专利技术可以通过以下措施来达到: 1.抗肿瘤寡肽的制备 (1)采用液相合成法和活化酯逐个增长法，将寡肽C端的第二个氨基酸的α-氨基用Boc基(叔丁氧羰酰基)保护，a -羧基用HOSu (N-羟基琥珀酰亚胺)活化，然后在KHCO3溶液中与C端第一个氨基酸30°C反应2天。抽去溶剂，在冰浴中调pH至3~4，抽提，饱和NaCl洗，无水Na2SO4干燥，抽干，研磨，得带保护基的二肽。用50% TFA(三氟醋酸)处理，脱去Boc基，再与N端带Boc保护基，C端用HOSu活化的C端第三个氨基酸缩合，用同样的方法逐个接上氨基酸，最后用催化氢化法脱去Glu侧链上的保护基OBzl (苄酯)，用50% TFA脱去八肽N端的Boc基，得粗肽，粗肽用HPLC进行分离纯化，纯度在96%以上。(2)采用固相合成法，从C端一N端逐个延长。参考书①黄惟德、陈常庆著，多肽合成，科学出版社，1985年。②N.休厄德、H.D.贾库布克著，刘克良、何军林等译，肽:化学与生物学，科学出版社，2005年。2.抗肿瘤寡肽的鉴定 抗肿瘤寡肽经5.7mol/LHCl水解16小时，用氨基酸自动分析仪进行氨基酸分析。经氨基酸序列仪分析其序列。经电喷雾质谱测定其分子量。3.抗肿瘤寡肽的抗肿瘤活性 (I)体外活性测定: 采用细胞培养和细胞计数的方法，人肝癌细胞7721以RPMI1640为培养基，人胃癌细胞MKN以DME/F12(1: 1)为培养基，视不同情况加入10%左右的小牛血清，用T-25培养瓶在37°C，5% CO2培养箱中单层培养。当细胞生长成单层后消化，用含1%小牛血清的培养液制成细胞悬液，按每孔1ml接种到24孔培养板上，37°C、5% CO2培养箱中培养4h后，加入不同剂量的抗肿瘤寡肽，对照组和实验组均设三个重复孔，对照组加入20 μl的PBS，试验组加入不同剂量的抗肿瘤寡肽，继续培养72小时后，吸出培养液，用PBS洗，然后每孔加入200 μl消化液消化，待细胞变圆后，加入800 μl的PBS，在倒置显微镜下用血球计数板计数。(2)体内活性测定: 50只健康昆明种小白鼠，体重20±2克，平均分五组，每组10只，雌雄各半或全部为雄鼠。将已接种S180肉瘤或Η22肝癌的荷瘤小鼠处死，无菌操作抽取其腹水，按1: 3比例稀释，配制成细胞悬液，于每只实验用小鼠的右前肢腋窝皮下注射0.2ml瘤细胞悬液，瘤细胞不少于105，植瘤24hr后，给药组分别以不同剂量进行静脉注射，以生理盐水作为阴性对照组，CTX为阳性对照组，连续注射7天后，于停药3天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称瘤重，计算抑瘤率。对于Lewis肺癌，植瘤24hr后，给药组、生理盐水和CTX组样品连续注射10天后，于停药4天时处死小鼠，剖取皮下瘤块，称癌重，计算抑瘤率。本专利技术公开的抗肿瘤寡肽与现有技术相比所具有的效果: 本专利技术合成了一个具有很强抑瘤作用的寡肽A0P-1。目前虽有文献报道抗肿瘤肽类，但大多数从海洋生物、植物及生物体中分离得到。我们合成的寡肽由天然氨基酸组成，分子量较小，便于人工合成，易于产业化，且抑瘤作用强，对正常白细胞、红细胞无影响，是一种安全、高效、理想的抗癌药物。我们还合成了 AOP-1的三个类似物A0P-2、A0P-3和A0P-4，也具有很强的抗肿瘤作用，可作为抗肿瘤药物。【具体实施方式】下面结合实施例说明本专利技术，这里所述实施例的方案，不限制本专利技术，本领域的专业人员按照本专利技术的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本专利技术的范围内，本专利技术的范围和实质由权利要求来限定。本专利技术所用到的各种试剂均有市售。实施例1: 抗肿瘤寡肽A0P-1的液相合成 采用液相合成法和活化酯逐个增长法:氨基酸的氨基用Boc基(叔丁氧羰酰基)保护，羧基用HOSu (N-羟基琥珀酰亚胺)活化，谷氨酸的侧链羧基用OBzl (苄酯)保护。Boc氨基酸羧基活化的方法:Boc氨基酸IOOmmol于70ml四氢呋喃(A.R)中，微热溶解，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤寡肽，其特征在于，所述抗肿瘤寡肽具有SEQ?ID?NO:1?4所述的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗肿瘤寡肽，其特征在于，所述抗肿瘤寡肽具有SEQ ID NO: 1-4所述的氨基酸序列。2.权利要求1所述抗肿瘤寡肽，其SEQID NO: 1-4序列为Tyr-X-Glu-Pro-Gly-Pro-Y-Ala，其中 X 为 Leu 或 lie, Y 为 Thr 或 Ser。3.权利要求2所述抗肿瘤寡肽，其中X为Leu，Y为Thr时，序列为Tyr-Leu-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala,所述抗肿瘤寡肽的分子量为 846.9。4.权利要求2所述抗肿瘤寡肽，其中X为He，Y为Thr时，序列为Tyr-1le-Glu-Pro-Gly-Pro-Thr-Ala,所述抗肿...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭丽，
申请(专利权)人：天津嘉宏科技有限公司，
类型：发明
国别省市：