本发明专利技术提供一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法，以纳米仿生Bruch’s膜作为视网膜色素上皮细胞载体，将视网膜色素上皮细胞接种到所述纳米仿生Bruch’s膜上，在低血清、低糖培养条件下复合培养，构建得到所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片；其中，所述纳米仿生Bruch’s膜是将原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶溶于有机溶剂中形成静电纺丝溶液，利用静电纺丝法对前述静电纺丝溶液进行静电纺丝所制得的超薄多孔的柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜。本发明专利技术制备方法得到的功能化RPE细胞移植片能有效避免传统方法出现的移植后RPE细胞易死亡、细胞极性错乱等问题，可广泛应用于细胞移植中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及再生医学组织工程领域，特别涉及一种。
技术介绍
年龄相关性黄斑变性(AMD)是世界范围内50岁以上常见的致盲疾病。其主要病因在于视网膜色素上皮(Retinal Pigment Epithelium, RPE)的结构或功能的异常而最终引起视网膜光感受器细胞的凋亡进而导致神经视网膜发生不可逆的变性。随着我国老龄化程度的增加，该类疾病导致的不可治性失明正成为当前国民经济建设和社会发展的重大负担。然而目前对此病的大部分治疗(ant1-VEGF药物等)均是针对并发症的措施，针对疾病晚期患者以及萎缩性(干性)AMD等毫无干预方法。进行RPE移植是有望攻克难治性AMD的最有效途径之一。国内外多个课题组的研究结果证实将RPE细胞注射至视网膜色素变性动物或者患者的视网膜下腔后，能明显改善视功能(Schwartz, Steven D.，et al.The Lancet, 2012, 379 (9817):713-720 ；Li, Y,et al.Molecular Medicine, 2012,18:1312-9 ；Carr, A.J.，et al.PLoS ONE,2009,4(12):e8152 ;)。将RPE细胞悬液移植到视网膜下腔后，细胞极易发生流失、凋亡、生长错位且极难维持细胞的极性。体内RPE是由RPE细胞在Bruch’ s膜上彼此紧密连接形成的极性细胞单层组织。Bruch’s膜为RPE细胞提供生长的微环境并对RPE细胞功能的发挥起着非常重要的作用。已有研研究将人RPE细胞种植在聚氨酯、聚乳酸、聚羟基丁酸戊酯等人工合成材料及胶原、蚕丝素蛋白等天然生物材料制备的膜上构建RPE细胞移植片(Binder, S., etal.British Journal of Ophthalmology, 2011,95 (4):441-2)。尽管人工合成材料具有良好的可塑性及力学特性，但细胞亲和力不够，而天然生物材料富含细胞识别信号分子，但是力学性能不佳，均难满足临床应用。此外，要形成功能化的RPE细胞移植片，需要较长的时间，然而这些膜是否能够长时间支持RPE细胞功能的形成及是否会引起炎症相关基因的表达等问题在已有的研究中很少涉及。
技术实现思路
本专利技术克服现有技术的缺陷，提出了一种，以静电纺丝法制得的超薄多孔柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生Bruch’s膜作为移植载体，将RPE细胞种植在该膜上，复合培养构建得到功能化RPE细胞移植片。本专利技术以纳米仿生Bruch’ s膜作为视网膜色素上皮细胞载体，将视网膜色素上皮细胞接种到所述纳米仿生Bruch’ s膜上,在低血清、低糖培养条件下复合培养,构建得到所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片。本专利技术中，进一步地，功能化视网膜色素上皮细胞移植片可根据需要裁剪成0.5-4mm2大小的移植单元。本专利技术中，获得所述纳米仿生Bruch’s膜的方法为:将原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶溶于有机溶剂中形成静电纺丝溶液，利用静电纺丝法对前述静电纺丝溶液进行静电纺丝所制得的超薄的、多孔的、柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜。其中，原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶的质量为比1-5%: 65-85%: 10-30%。本专利技术中，制备所述纳米仿生Bruch’ s膜的方法为:①.将柞蚕丝脱胶，再经溶解、透析、纯化和冷冻干燥后得到纯的柞蚕丝素蛋白；②.取柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶，溶解于有机溶剂中，室温下，磁力搅拌器上搅拌过夜。得到柞蚕丝素蛋白:聚己内酯:明胶(质量百分比为1-5: 65-85: 10-30)电纺液；优选地，柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶在所述静电纺丝溶液中的质量比为5%: 85%: 10%。③.所述原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶三种原料的质量总和与所述有机溶剂的体积比为10% -30%。优选地，柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶三种原料的质量总和与所述有机溶剂的体积比为25%。④.将2中电纺液装入注射器中，装上0.6-1.2的钝性针头，调整针头到接收器的距离10-20cm，调节电压在10-30KV，纺丝液挤出速度控制在0.5_3mL/h ；⑤.在静电场中制备纳米仿生Bruch’ s膜；⑥.获得的所述纳米仿生Bruch’ s膜置于通风厨或恒温鼓风干燥箱中1_4小时，使残留的有机试剂完全挥发，得到所述超薄多孔柞蚕丝素蛋白/`聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生Bruch’s膜。该纳米仿生Bruch’s膜纤维直径可控制在50_500nm,纤维膜中的孔径可在100-4000nm范围内调节，膜厚度2-200 μ m ；本专利技术中，所述纳米仿生Bruch’ s膜在接种视网膜色素上皮细胞之前的预处理为:将所述纳米仿生Bruch’ s膜置入6孔板中，加入75%乙醇浸泡，然后除去乙醇，缓冲液浸泡后晾干；具体步骤包括:①纳米仿生Bruch’ s膜置入6孔板中，加入75%乙醇浸泡30_120min后；②吸除乙醇，超净台上待乙醇完全挥发；③加入PBS或HBSS缓冲液浸泡纳米仿生Bruch’ s膜2次；④超净台上晾干后用于细胞接种。本专利技术中，所述接种RPE细胞到视网膜色素上皮细胞载体上的方法为:所述视网膜色素上皮细胞体外培养(DMEM/F12+10% +1%青链霉素)至细胞融合后，以0.05%胰蛋白酶-EDTA消化，取密度为I X IOVmL的视网膜色素上皮细胞悬液400 μ L至所述纳米仿生Bruch’ s膜的表面，将所述视网膜色素上皮细胞悬液涂布均匀，移至二氧化碳培养箱中培养；补加培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清+1%青链霉素)继续培养；待所述视网膜色素上皮细胞融合成单层时，更换低糖低血清培养基继续培养。本专利技术中，视网膜色素上皮细胞为原代分离或各种干细胞分化来的视网膜色素上皮细胞或经基因修饰的视网膜色素上皮细胞。所述干细胞是胚胎干细胞、诱导多能干细胞、各种成体干细胞、以及采用治疗性克隆技术制备的干细胞等。[0021 ] 本专利技术中，所述低糖低血清培养基为在含lg/L葡萄糖和110mg/L丙酮酸钠的DMEM基础培养基中添加I %胎牛血清与I %青链霉素，每周换液2次。本专利技术还提供一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片，其包括:纳米仿生Bruch’s膜、以及接种在所述纳米仿生Bruch’s膜上的视网膜色素上皮细胞；其中，所述纳米仿生Bruch’ s膜作为视网膜色素上皮细胞载体。其中，所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片是按本专利技术方法制备得到的。本专利技术采用具有生物活性的超薄、多孔的柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维仿生Bruch’ s膜作为RPE细胞移植载体。该移植载体采用富含RGD细胞识别模序的柞蚕丝素蛋白与力学性能优异的聚己内酯，同时共混富含亲水基团的明胶，实现了材料间优势互补，克服了传统单独人工材料或天然材料的不足缺陷，使得制备的仿生膜既有很好的细胞亲和性，同时具有很好的力学性能。此外，应用静电纺丝技术，仿生天然RPE细胞生存的细胞外基质三维网状、多孔结构(Bruch’s膜)，既利于营养物质、化学信号分子的传递，同时也利于细胞代谢废物的排出。本专利技术制备方法是一种将人视网膜色素上皮细胞与仿生超薄多孔柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜复合培养，体外构建功能化视网膜色素上皮本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法，其特征在于，以纳米仿生Bruch’s膜作为视网膜色素上皮细胞载体，将视网膜色素上皮细胞接种到所述纳米仿生Bruch’s膜上，在低血清、低糖培养条件下复合培养，构建得到所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片；其中，所述纳米仿生Bruch’s膜是将原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶溶于有机溶剂中形成静电纺丝溶液，利用静电纺丝法对前述静电纺丝溶液进行静电纺丝所制得的超薄多孔的柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜。
【技术特征摘要】
1.一种功能化视网膜色素上皮细胞移植片的制备方法，其特征在于，以纳米仿生Bruch’ s膜作为视网膜色素上皮细胞载体，将视网膜色素上皮细胞接种到所述纳米仿生Bruch’ s膜上，在低血清、低糖培养条件下复合培养，构建得到所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片；其中，所述纳米仿生Bruch’ s膜是将原料柞蚕丝素蛋白、聚己内酯、明胶溶于有机溶剂中形成静电纺丝溶液，利用静电纺丝法对前述静电纺丝溶液进行静电纺丝所制得的超薄多孔的柞蚕丝素蛋白/聚己内酯/明胶复合纳米纤维膜。2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述功能化视网膜色素上皮细胞移植片可根据需要裁剪成0.5-4mm2大小的移植单元。3.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述接种的方法为:所述视网膜色素上皮细胞体外培养至细胞融合后，以0.05%胰蛋白酶-EDTA消化，取密度为I X 106/mL的视网膜色素上皮细胞悬液400 μ L至所述纳米仿生Bruch’s膜的表面，将所述视网膜色素上皮细胞悬液涂布均匀，移至二氧化碳培养箱中培养；补加培养基继续培养；待所述视网膜色素上皮细胞融合成单层时，更换低糖低血清...
【专利技术属性】
技术研发人员：金子兵，向萍，李敏，项略，
申请(专利权)人：温州医科大学，福建师范大学，
类型：发明
国别省市：
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