miR-493基因在制备抑制癌细胞增殖药物中的用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及miR-493基因在制备抑制癌细胞增殖药物中的用途。95D细胞系中miR-493的一种靶基因，miR-493通过与靶基因mRNA的3’-UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶基因的mRNA。结合生理生化实验，确定了miR-493与E2F1有相互作用。这种相互作用影响了95D细胞的增殖等生命活动。本实验通过软件预测，测序分析，并构建载体，在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了E2F1是miR-493的靶基因，并在95D细胞中利用过表达和Western-blot的技术，以及干扰E2F1基因表达作为对照，进一步证实了该发现。所公开的为在95D细胞系中E2F1是miR-493的靶基因的首次报道，该发明专利技术为在临床上利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了应用价值。

【技术实现步骤摘要】
miR-493基因在制备抑制癌细胞增殖药物中的用途
本专利技术属于生物
，具体地讲，涉及miR-493基因在抑制非小细胞肺癌细胞增殖中的应用。
技术介绍
microRNAs(miRNAs)是一类进化上保守、长约19-25个核苷酸的非编码小分子RNA。Lee及Reinhart等相继在线虫中发现具有基因调控作用的非编码单链RNA分子，lin-4和let-7。随后大量的研究发现在各种生物体中均存在这种小分子RNA，它们具有组织特异性和时空性。这种具有基因调控作用的非编码小RNA分子被称作microRNAs(miRNAs)。miRNAs以完全或不完全互补配对的方式与靶基因的mRNA的3’端非翻译区(3’UTR)结合，导致靶mRNA的降解或者抑制其翻译，进而对功能基因的表达发挥精细调控功能。miRNAs参与各种细胞进程，如分化、增殖、凋亡以及应激反应。此外，它们还是某些肿瘤的关键调节点。自2002年Calin等首次发现miRNAs与B细胞慢性淋巴性白血病有关后，miRNAs与肿瘤的关系备受关注。此后的大量研究都表明miRNAs与多种肿瘤(肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等)的发生发展密切相关，在肿瘤细胞的增殖、血管发生、EMT、肿瘤细胞的侵袭与转移、耐药以及肿瘤干细胞等生物学功能中起着重要的调节作用。在此基础上，寻找miRNA在特定时空中的靶基因，揭示其作用机制是目前研究的重点，也是进一步阐述肿瘤发生发展机制、识别和鉴定新的肿瘤标志物的重要研究手段。肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，近十年其发病率和死亡率均迅速上升，在我国高居恶性肿瘤死亡率的首位，已成为严重威胁人们生命健康的重大疾病。根据肺癌的生物学特性，分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC约占80-85％，近年来，随着治疗方式的改进，治疗方案的调整，肺癌的治疗取得了长足的进步，但是大部分的NSCLC患者预后仍然较差，5年生存率仍低于15％。缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段是导致肺癌患者死亡的最主要原因之一。miRNA通过调控靶基因的mRNA翻译，在肺癌的发生发展及转移中发挥重要作用。miRNA可能成为新的肺癌早期诊断和进展相关标记物，有助于肺癌的准确诊断及个性化治疗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可以有效抑制癌细胞增殖的药物。专利技术通过以下技术方案实现上述目的。专利技术提供了miR-493基因或含有该基因的表达载体在制备抑制癌细胞药物中的用途。所述的药物为抑制癌细胞增殖的药物。进一步地，所述的癌细胞的增殖机制与E2F1相关。作为优选的方案，所述的癌为肺癌、卵巢癌、头颈部肿瘤等。更优选地，癌细胞为非小细胞肺癌。进一步优选地，所述的癌细胞为95D。所述的miR-493基因序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。所述的药物的制剂形式可以是常规的制剂，如液体制剂、颗粒剂、片剂或胶丸。其还包括要学上可接受的载体。专利技术同时提供了miR-493基因或含有该基因的表达载体在制备E2F1抑制剂中的用途。本专利技术首次提供了miR-493基因作为在癌中抑制肿瘤增殖新的应用，为抗肿瘤药物的设计和筛选提供了新的靶点。本专利技术的研究思路进一步简述如下：专利技术人首先利用RT-PCR检测2株正常细胞和6株肺癌细胞miRNA的表达，发现相比于正常肺细胞，miR-493在肺癌细胞中普遍低表达，以高转移潜能的非小细胞肺癌95D细胞株尤为明显。进一步，构建miR-493过表达慢病毒载体pEZX-MR03/eGFP-miR-493(该载体带绿色荧光蛋白)及空白对照载体，分别转染95D细胞，建立过表达miR-493的稳定细胞系95D/miR-493，以及对照组95D/control。并用实时荧光定量PCR验证转染效果。应用平板克隆形成实验、细胞生长曲线检测各组细胞的增殖能力，流式分析细胞周期，发现肺癌细胞的增殖能力明显受抑制。进一步，利用生物信息学在线预测软件分析并结合生物学功能，筛选出miR-493可能的靶基因。采用实时定量PCR、WesternBlot技术检测靶基因的表达，并将miR-493的成熟序列minics和重组有靶基因的3’UTR区序列的双荧光素酶报告基因共转染HEK293细胞，24h后检测荧光素酶报告基因的活性。同时利用RNAi技术干扰肺癌细胞中靶基因的表达水平作为对照。生物信息学在线预测软件分析筛选出miR-493的靶基因E2F1。实时定量PCR及WesternBlot发现E2F1的转录和蛋白水平表达均与miR-493成负相关。双荧光素酶报告基因结果证实miR-493对E2F1表达具有直接抑制作用。E2F1的表达沉默能使95D细胞G0/G1期细胞比例增高，S期细胞比例减少，生长曲线结果显示E2F1干扰后细胞增殖速度减慢。这一结果支持miR-493抑制95D肺癌细胞增殖的分子机制与E2F1有关。本专利技术所提供的基因药物可以有效地抑制与E2F1有关的癌细胞的增殖。附图说明图1显示95D/miR-493与95D/control稳定细胞系的构建：A：转染72小时后在倒置荧光显微镜下观测细胞内绿色荧光信号；B：实时荧光定量PCR检测95D/miR-493与95D/control细胞系miR-493的表达水平，*：p<0.05，**：p<0.01。图2显示为过表达miR-493对95D细胞增殖能力的影响：A：95D、95D/control和95D/miR-493平板克隆形成实验的典型图；B：95D、95D/control和95D/miR-493各组细胞的克隆形成率的统计分析，实验重复3次，95D/miR-493vs95D，**p＜0.01；C：MTS法绘制各组细胞生长曲线。图3显示为流式细胞仪检测95D、95D/control和95D/miR-493的细胞周期分布。各组细胞的增殖指数分别为：48.49％，56.30％，19.23％。该实验重复3次，统计分析显示95D/miR-493组与另两组细胞的增殖指数有统计学差异。图4显示miR-493直接靶向E2F1并抑制其表达：A:生物信息学分析E2F1的3’UTR区miR-493存在的结合位点；B：95D/miR-493及对照组细胞E2F1的蛋白水平的差异；C：95D/miR-493及对照组细胞E2F1mRNA水平的差异；D:miR-493对E2F1的3’UTR区构建载体的报告基因活性的影响。图5显示为si-RNA干扰95D细胞E2F1基因表达：A：在mRNA水平检测3条siRNA干扰效果；B：在蛋白水平检测3条siRNA干扰效果。图6显示作为miR-493作用的对照，siRNA干扰E2F1表达后，对肺癌细胞增殖的影响：A：流式检测干扰前后细胞周期分布；其中横坐标DNAcontent指DNA含量；纵坐标cellnumber指细胞数量；B：MTS绘制干扰前后细胞的生长曲线。上述图中，所涉及的95D/control所指为95D对照细胞系，其不含有miR-493。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步的描述；实施例仅作为本专利技术技术方案的解释，而非限制。实施例1：细胞培养人低转移肺癌细胞95C及人高转移肺癌细胞95D购自上海中科院细胞库。均用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养，置于37℃，5％本文档来自技高网...

【技术保护点】
miR?493基因或含有该基因的表达载体在制备抑制癌细胞药物中的用途。

【技术特征摘要】
1.miR-493或含有miR-493的表达载体在制备抑制非小细胞肺癌药物中的用途。2.如权利要求1所述用途，其特征在于所述的药物为抑制癌细胞增殖的药物。3.如权利要求1所述用途，其特征在于所述的非小细胞肺癌细胞为95D。4.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺智敏，谷依学，程烨，张志杰，王成昆，
申请(专利权)人：广州医科大学附属肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：