一种大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法技术

一种大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法，本方法选取生长健壮的大苞鞘石斛母株，于开花时进行人工授粉，将授粉后发育至基本成熟而未开裂时的果实作为外植体，并经过无菌播种、分化培养、增殖培养、生根培养、壮苗培养基试管苗移栽等繁殖步骤。本发明专利技术具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的试管苗，成苗的移栽成活率90%以上。能为大苞鞘石斛的种苗生产及资源保护提供一条有效的途径。

【技术实现步骤摘要】
—种大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法
本专利技术涉及植物生物
，具体属于一大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法。
技术介绍
大荀鞘石斛又名腾冲石斛，学名生于海拔1350~1900 m的山地疏林中树干上，主要分布于中国云南东南部至西部以及緬甸、泰国和印度东北部等地的热带雨林中，属附生兰。花期:1-5月，总状花序具1- 3朵花，花被片白色，边缘带紫色，唇瓣顶端紫色基部金黄色，花梗和子房白色带淡紫红色，花大(花径9.5 cm左右)、开展，花色艳丽，是石斛兰中花大、色艳，观赏价值很高的种类；其茎可作药用，药品名称为扁黄草，性甘，微寒，具有益胃生津，滋阴清热等功效。我国石斛兰原种资源丰富，但由于生境破坏、过渡采集及较长时期缺乏保护，野生资源数量明显下降，针对这一状况我们应当加快对我国石斛兰原种种质资源的研究与开发，提高繁殖速度和促进种质保存，从而减缓人为破坏和资源濒危的局面；鉴于石斛兰的鉴定分类比较困难，甚至某些种类只有开花时才可鉴定，为此我们需要建立种质资源库，收集和整理我国石斛兰原种资源，为 资源的有效保存、研究打下基础；加强对野生石斛兰资源的保护、开发与利用；加强和深化观赏石斛兰的育种研究，提高育种水平，培育出观赏价值高、具有自主知识产权的新优品种，同时要以工厂化、规模化生产为目标，着力解决有开发前景的石斛兰原种的快繁体系研究，且可结合试管苗和人工种子野生放养达到可持续发展的目的。
技术实现思路
本专利技术提供了。本专利技术采用的技术解决方案是: ，其特征在于:所述的方法包括以下步骤: (1)选材:大苞鞘石斛兰开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后果实成熟且外植体未开裂时作为外植体用播种； (2)萌发培养:将外植体用75%酒精擦拭表面，洗洁精清洗30min后自来水冲洗1 h，移置于超净工作台上，用75%的酒精消毒60 S，无菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15 min并摇动，无菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛种胚，将种胚播于B5、绵白糖20 g/L—1、椰乳20%、琼脂7.6 g/L-1混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.4的萌发培养基上，培养50天，种胚萌发成原球茎； (3)分化培养:将原球茎转接于花宝I号3g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、马铃薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节PH为5.6的分化培养基上进行分化培养，培养时间70天，萌发后的绿色原球茎，接种10天后，最后形成完整植株小苗； (4)增殖培养:选取分化后的小苗接入CHB、NAA0.5、6_BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.8的增殖培养基上进行丛生芽增殖培养，培养150天长成无菌大苗； (5)生根诱导培养:将增殖后的无菌大苗转入花宝2号3g/L、蛋白胨2 g/L、IBA I mg/L、椰乳10%、蔗糖30 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.6的生根诱导培养基进行生根诱导，培养45天； (6)壮苗培养:将生根诱导的无菌苗在花宝I号3g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L、活性炭I g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.6的壮苗培养基做壮苗生根培养，培养90天； (7)试管苗移栽:无菌苗壮苗生根培养后栽植于1:1:0.5的松树皮+珍珠岩+兰花基石中，栽培基质采用121 °C高压蒸汽灭菌消毒120 min，栽培条件为遮阴40%的自然光照条件，80%相对湿度，25~29 °C。所述的大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法，其特征在于:所述的大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法的所有步骤均在培养温度为(23±1) °C，光照强度15001ux,光照时间16 h/d的条件下进行。本专利技术的有益效果是:本专利技术提供一种大苞鞘石斛的种苗试管繁殖无菌播种和组织培养方法，本方法选取生长健壮的大苞鞘石斛母株，于开花时进行人工授粉，将授粉后发育至基本成熟而未开裂时的果实作为外植体，并经过无菌播种、分化培养、增殖培养、生根培养、壮苗培养基试管苗移栽等繁殖步骤。本专利技术具有种子萌发率高、成苗快、种苗品质好等特点，能在短期内获得大量的试管苗，成苗的移栽成活率90%以上。【附图说明】图1为大苞鞘石斛种胚萌发过程图。图2为大苞鞘石斛萌发培养图。图3为大苞鞘石斛分化培养图。图4为大苞鞘石斛增殖培养图。图5为大苞鞘石斛生根培养图。图6为大苞鞘石斛壮苗培养图。图7为大苞鞘石斛移栽驯化培养图。实施例1: 无菌播种和组织培养的条件:培养温度为(23±1) °C，光照强度15001UX，光照时间16h/d 1、材料:大苞鞘石斛开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后果实210天成熟时作为外植体用播种。2、萌发培养:将外植体用75%酒精擦拭表面，洗洁精清洗30 min后自来水冲洗Ih，移置于超净工作台上，用75%的酒精消毒60 S，无菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15min并摇动，无菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛种胚，将种胚播于B5、绵白糖20 g/L—1、椰乳20%、琼脂7.6 g/L-1混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.4的萌发培养基上，培养50天，种胚萌发成原球茎，原球茎长势一致，色泽鲜绿，形状饱满，直径在0.65 mm左右(图1、2)。3、分化培养:将原球茎转接于花宝I号3 g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、马铃薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.6的分化培养基上进行分化培养，培养时间70天，萌发后的绿色原球茎，接种10天后，从原球茎顶端产生叶原基凸起，逐渐发育成幼叶，最后形成完整植株(图3)，小苗高16.5mm左右。4、增殖培养:选取分化后的小苗接入CHB、NAA 0.5、6_BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.8的增殖培养基上进行丛生芽增殖培养，培养150天(图4)。小苗接入培养基后10天根系开始生长，20天茎部增粗，30天茎基部分化不定芽，此阶段基本没有苗进行高生长，之后茎基部的不定芽不断增加生长，最初接入的小苗老化死亡。新生的不定芽叶片长度和宽度指标明显高于接入时的小苗，并且开始进行高生长，节间明显，具2节。当不定芽长到一定程度时又开始以自身作为母株进行不定芽的增殖，并在增殖到一定数量后老化死亡。5、将增殖后的无菌大苗转入花宝2号3 g/L、蛋白胨2 g/L、IBA I mg/L、椰乳10%、蔗糖30 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.6的生根诱导培养基进行生根诱导，培养45天，苗体健壮，生根率100%，生根粗壮，根毛丰富，平均根数2.3条(图5)。6、壮苗培养:将生根诱导的无菌苗在花宝I号3 g/L、蛋白胨2 g/L、蔗糖30 g/L、活性炭I g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的用盐酸或者氢氧化钠调节pH为5.6的壮苗培养基做壮苗生根培养，培养90天，植株健壮(茎高3cm以上，茎粗3mm左右)、叶片本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法，其特征在于：所述的方法包括以下步骤：（1）选材：大苞鞘石斛兰开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后果实成熟且外植体未开裂时作为外植体用播种；（2）萌发培养：将外植体用75%?酒精擦拭表面，洗洁精清洗30?min后自来水冲洗1?h，移置于超净工作台上，用75%的酒精消毒60?s，无菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15?min并摇动，无菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛种胚，将种胚播于B5、绵白糖20?g/L?1、椰乳20%、琼脂7.6?g/L?1混合配制的pH?调节为5.4的萌发培养基上，培养50天，种胚萌发成原球茎;（3）分化培养：将原球茎转接于花宝1号3?g/L、蛋白胨2?g/L、NAA?0.2??mg/L、椰乳10%?、马铃薯提取液10%、葡萄糖20?g/L、琼脂7.6?g/L混合配制的pH调节为5.6的分化培养基上进行分化培养，培养时间70?天，萌发后的绿色原球茎，接种10天后，最后形成完整植株小苗;（4）增殖培养：选取分化后的小苗接入CHB、NAA?0.5、6?BA?0.2、椰乳10%?、蔗糖30?g/L、琼脂7.6?g/L混合配制的pH?调节为5.8的增殖培养基上进行丛生芽增殖培养，培养150?天长成无菌大苗；?（5）生根诱导培养：将增殖后的无菌大苗转入花宝2号3?g/L、蛋白胨2?g/L、IBA?1?mg/L、?椰乳?10%、?蔗糖30?g/L、琼脂7.6?g/L混合配制的pH?调节为5.6的生根诱导培养基进行生根诱导，培养45?天；?（6）壮苗培养：将生根诱导的无菌苗在花宝1号3?g/L、蛋白胨2?g/L、蔗糖30?g/L?、活性炭1?g/L、琼脂7.6?g/L混合配制的pH调节为5.6的壮苗培养基做壮苗生根培养，培养90?天；（7）试管苗移栽：无菌苗壮苗生根培养后栽植于1：1：0.5的松树皮+珍珠岩+兰花基石中，栽培基质采用121?℃高压蒸汽灭菌消毒120?min，栽培条件为遮阴40%的自然光照条件，80%相对湿度，25~29℃。...

【技术特征摘要】
1.一种大苞鞘石斛兰的无菌播种和组织培养的方法，其特征在于:所述的方法包括以下步骤: (1)选材:大苞鞘石斛兰开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉后果实成熟且外植体未开裂时作为外植体用播种； (2)萌发培养:将外植体用75%酒精擦拭表面，洗洁精清洗30min后自来水冲洗I h，移置于超净工作台上，用75%的酒精消毒60 S，无菌水清洗2次，0.1%升汞溶液消毒15 min并摇动，无菌水清洗5次，取出大苞鞘石斛种胚，将种胚播于B5、绵白糖20 g/L—1、椰乳20%、琼脂7.6 g/L—1混合配制的pH调节为5.4的萌发培养基上，培养50天，种胚萌发成原球茎； (3)分化培养:将原球茎转接于花宝I号3g/L、蛋白胨2 g/L、NAA 0.2 mg/L、椰乳10%、马铃薯提取液10%、葡萄糖20 g/L、琼脂7.6 g/L混合配制的pH调节为5.6的分化培养基上进行分化培养，培养时间70天，萌发后的绿色原球茎，接种10天后，最后形成完整植株小苗； (4)增殖培养:选取分化后的小苗接入CHB、NAA0.5、6-BA 0.2、椰乳10%、蔗糖30...

【专利技术属性】
技术研发人员：王伟，卢珊，金荷仙，陈香波，夏守慧，康华靖，徐双双，
申请(专利权)人：温州科技职业学院，
类型：发明
国别省市：