用于增强植物中组成型基因表达的调节性核酸分子制造技术

本发明专利技术属于植物分子生物学领域并且提供了用于产生高表达的组成型启动子的方法和产生具有增强的核酸组成型表达的植物的方法，其中将增强核酸表达的核酸(NEENA)与所述启动子功能性连接和／或导入植物中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增强植物中组成型基因表达的调节性核酸分子专利技术描述本专利技术属于植物分子生物学领域并且提供了用于产生高表达的组成型启动子和产生具有增强的核酸组成型表达的植物的方法，其中将增强核酸表达的核酸(NEENAs)与所述启动子功能性连接和/或导入植物中。转基因在植物中的表达强烈地受多种外部和内部因素影响，从而导致变动和不可预测水平的转基因表达。经常不得不产生大量的转化体并进行分析，以鉴定具有合乎需要的表达强度的株系。由于转化并筛选表达强度合乎需要的株系是昂贵和耗费人力的，故需要一个或多个转基因在植物中高表达。当不得不在转基因植物中协调表达几个基因以实现特定效应时，鉴于必须鉴定其中每个基因均强烈表达的植物，这个问题尤其严重。例如，取决于构建体设计和各个转化事件中T-DNA插入基因座的位置效应，转基因的表达可以显著地变动。强启动子可以部分地克服这些难题。然而，显示强烈表达同时特异性合乎需要的合适启动子的可获得性经常是有限的。为了确保可获得具有合乎需要的表达特异性的充足启动子，额外启动子的鉴定和表征可能有助于弥合这种缺口。然而，具有相应特异性和强度的启动子的天然可获得性和费时的候选启动子表征阻碍了合适的新启动子的鉴定。 为了克服这些难题，已经显示多样的遗传元件和/或基序积极地影响基因表达。在它们当中，已经认可一些内含子作为具有改善基因表达的强大潜能的遗传元件。虽然机制大多未知，但是已经显示一些内含子积极地影响成熟mRNA的稳态量，这可能通过增强转录活性、改善mRNA成熟、增强胞核mRNA输出和/或改善翻译起始来影响(例如Huang和Gorman, 1990 ；Le Hir等人,2003 ;Nott等人,2004)。由于显示仅所选的内含子增加表达,故剪接本身很可能解释不了观察到的效果。将内含子与启动子功能性连接时观察到的基因表达增加称作内含子介导的基因表达增强aME)并且已经在多种单子叶植物(例如Callis等人，1987 ；Vasil等人，1989 ；Bruce等人，1990 ；Lu等人,2008)和双子叶植物(例如Chung等人,2006 ；Kim等人,2006 ；Rose等人，2008)中得到显示。在这个方面，显示内含子相对于翻译起始位点(ATG)的位置对于内舍子介导的基因表达增强至关重要(Rose等人，2004)。继一些内含子增强基因表达的潜能之后，显示这些内含子还在植物中于其原有核苷酸环境下影响组织特异性。发现报道基因表达依赖于含有多达2个内含子的基因组区域的存在(Sieburth等人，1997 ；ffang等人，2004)。也已经报道5’ UTR内含子对启动子元件的恰当功能性是重要的，这可能归因于内含子中存在的组织特异性基因控制元件(Fu等人，1995a ;Fu等人，1995b ;Vitale等人，2003 ;Kim等人，2006)。然而，这些研究还显示内含子与异源启动子的组合可能对基因表达的强度和/或特异性产生强烈的不利影响(vitale等人，2003 ;Kim 等人，2006、W02006 / 003186、W02007 / 098042)。例如，通过与芝麻SeFAD25’ UTR内含子组合而不利地影响花椰菜花叶病毒CaMV35S组成型强启动子(Kim等人，2006)。与这些观察结果相反，一些文献显示通过IME增强核酸的表达而不影响相应启动子的组织特异性(Schiinmann等人,2004)。在WO / 2011 / 023537和WO / 2011 / 023539中，作者描述了一些核酸分子，当其功能性连接启动子时，增强这些启动子的表达而不影响相应启动子的特异性。在本申请中，描述了与组成型启动子功能性连接时增强所述启动子的表达同时不影响其特异性的其他核酸分子。在本申请中将这些核酸分子描述为“增强核酸表达的核酸”(NEENA)。内含子具有从相应的前mRNA剪接下来的内在特征。与其相反，本申请中即将陈述的核酸不必要一定包含于mRNA中，或如果存在于mRNA中，没有必要一定从mRNA中剪接下来，以增强源自与NEENA功能性连接的启动子的表达。专利技术详述本专利技术的第一实施方案包括用于产生高表达的组成型启动子的方法，所述方法包括将启动子与一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)分子功能性连接，所述NEENA分子包括i)具有如SEQ ID NO:1至14937和14958至14960的任一者中所定义序列的核酸分子，或ii)具有下述序列的核酸分子，所述序列与如SEQ ID NO:1至14937或14958至14960所定义的任一序列具有80 %或更大的同一性，优选地，该同一性是85 %或更大，更优选地，该同一性是90%或更大，甚至更优选地，该同一性是95%或更大、96%或更大、97%或更大、98%或更大或99%或更大，在最优选的实施方案中，该同一性相对于如SEQ ID NO:I至14937或14958至14960所定义的任一序列是100%，或 iii) i)或ii)的核酸分子的100个或更多连续碱基、优选地150个或更多连续碱基、更优选地200个或更多连续碱基、或甚至更优选地250个或更多连续碱基的片段，所述片段具有如具备SEQ ID NO:1至14937或14958至14960所定义任一序列的相应核酸分子那样的增强表达活性，例如65%或更大、优选地70%或更大、更优选地75%或更大，甚至更优选地80%或更大、85%或更大或90%或更大，在一个最优选的实施方案中，95%或更大的增强表达活性，或iv)作为在前文i)至iii)下提及的核酸分子中任一者的互补物或反向互补物的核酸分子，或V) 100个或更多核苷酸、150个或更多核苷酸、200个或更多核苷酸或250个或更多核苷酸的核酸分子，所述核酸分子在等同于在50°C于7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4UmM EDTA杂交，以及在50°C或65°C、优选地65°C于2 X SSC、0.1% SDS中洗涤的条件下与包含由SEQ ID NO:1至14937或14958至14960描述的增强转录的核苷酸序列或其互补物的至少50个、优选地至少100、更优选地至少150、甚至更优选地至少200、最优选地至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交。优选地，所述核酸分子在等同于在50°C于7%十二烷基硫酸钠(sDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA杂交，以及在50°C或65°C、优选地65°C于I X SSC、0.1% SDS中洗涤的条件下与包含由SEQ ID NO:1至14937或14958至14960描述的增强转录的核苷酸序列或其互补物的至少50个、优选地至少100、更优选地至少150、甚至更优选地至少200、最优选地至少250个连续核苷酸的核酸分子杂交；更优选地，所述核酸分子在等同于在50°C于7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4UmM EDTA杂交，以及在50°C或65°C、优选地65°C于0.1XSSC、0.1% SDS中洗涤的条件下与包含由SEQ ID NO:1至14937或14958至14960任一序列描述的增强转录的核苷酸序列或其互补物的至少50个、优选地至少100、更优选地至少150、甚至更优选地至少200、最优选地至少250个本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于产生高表达组成型植物启动子的方法，包括将一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)分子与启动子功能性连接，其中所述增强核酸表达的核酸(NEENA)分子相对于所述启动子是异源的，其包含i)具有如SEQ?ID?NO：1至14937和14958至14960中所定义序列的核酸分子，或ii)具有与SEQ?ID?NO：1至14937或14958至14960具备至少80％同一性的序列的核酸分子，或iii)i)或ii)的核酸分子的100个或更多连续碱基的片段，所述片段具有如具有序列SEQ?ID?NO：1至14937或14958至14960的相应核酸分子那样的增强表达的活性，或iv)作为前述在i)或ii)下提及的任一核酸分子的互补物或反向互补物的核酸分子，或v)核酸分子，其在等同于50℃于7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4、1mM?EDTA杂交，以及50℃于2×SSC、0.1％SDS中洗涤的条件下与包含由SEQ?ID?NO：1至14937或14958至14960描述的增强转录的核苷酸序列的至少50个连续核苷酸的核酸分子杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.05 EP 11172672.51.用于产生高表达组成型植物启动子的方法，包括将一个或多个增强核酸表达的核酸(NEENA)分子与启动子功能性连接，其中所述增强核酸表达的核酸(NEENA)分子相对于所述启动子是异源的，其包含 i)具有如SEQID NO:1至14937和14958至14960中所定义序列的核酸分子，或 ii)具有与SEQID NO:1至14937或14958至14960具备至少80%同一性的序列的核酸分子，或 或ii)的核酸分子的100个或更多连续碱基的片段，所述片段具有如具有序列SEQ ID NO:1至14937或14958至14960的相应核酸分子那样的增强表达的活性，或 iv)作为前述在i)或ii)下提及的任一核酸分子的互补物或反向互补物的核酸分子，或 V)核酸分子，其在等同于50°C于7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaP04、lmM EDTA杂交，以及50°〇于2父55(:、0.1%305中洗涤的条件下与包含由5￡0 ID NO:1至14937或14958至14960描述的增强转录的核苷酸序列的至少50个连续核苷酸的核酸分子杂交。2.用于产生植物或其部分的方法，所述植物或其部分与相应的对照植物或其部分相比具有一种或多种核酸分子的增强的组成型表达，所述方法包括步骤 a)将包含权利要求1的i)至V)中所定义核酸分子的一个或多个NEENA导入所述植物或其部分； 和 b)将所述一个或多个NEENA与组成型启动子和与处在所述组成型启动子控制下的核酸分子功能性连接，其中NEENA对所述核酸分子为异源。3.根据权利要求1和2所述的方法，包括步骤 a)将包含权利要求1的i)至V)中所定义核酸分子的一个或多个NEENA导入植物或其部分，和 b)将所述一个或多个NEENA整合至所述植物或其部分的基因组中，从而所述一个或多个NEENA与相对所述一个或多个NEENA为异源的内源组成型表达的核酸功能性连接，和任选地 c)从所述转化的细胞再生出包含所述一个或多个NEENA的植物或其部分。4.根据权利要求1至3所述的方法，包括步骤 a)提供包含一个或多个NEENA的表达构建体，所述NEENA包含权利要求1的i)至v)中所定义的、与组成型启动子和与相对于所述一个或多个NEENA为异源并处在所述组成型启动子控制下的一种或多种核酸分子功能性连接的核酸分子，和 b)将包含所述一个或多个NEENA的所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·V·哈廷格，M·H·斯图维勒，J·M·库恩，A·N·伯格梅尔，
申请(专利权)人：巴斯夫植物科学有限公司，
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