利用包含MHC I类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞清除靶细胞制造技术

本文中报告一种复合物，其包含特异性结合靶抗原的抗体衍生部分（作为第一部分）和连接至MHC?I类蛋白质复合物的病毒衍生肽（作为第二部分）。凭借本文中报告的复合物，通过给个体现有的、循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞（T记忆细胞或T效应细胞）装饰模拟急性病毒感染的MHC?I类复合物，能将这些细胞引导至表达（共价复合物的抗体衍生部分特异性结合的）靶抗原的细胞。如此，本文中报告的一个方面是一种复合物，特征在于它包含一条融合多肽，其以N至C端方向包含(i)β2-微球蛋白，和(ii)相对频率小于1%的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，或(i)病毒衍生肽，(ii)β2-微球蛋白，和(iii)相对频率为1%或更多的I类MHC分子的胞外域α1、α2和α3，和通过一个或多个二硫键连接的两条多肽链，其中第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含(i)免疫球蛋白轻或重链可变域，(ii)免疫球蛋白轻或重链恒定域，和(iii)抗体重链铰链区多肽，且第二二硫化物连接的多肽链包含抗体重链铰链区多肽，其中该融合多肽共价结合至二硫化物连接的多肽链之一的C端或N端，或共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用包含MHC I类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞清除靶细胞本文中报告一种包含抗体和MHC I类成分的融合多肽及其通过靶向吸引循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞用于清除肿瘤细胞的用途。专利技术背景MHC I类蛋白质由α链(α-1至3和跨膜域)和β2_微球蛋白组成。它是多基因的(单倍体基因组中有MHC-1类蛋白质的3个基因座)，产生六种不同MHC I类蛋白质α链(在人中，两种HLA-A、两种HLA-B、两种HLA-C)。MHC还是多态的。人HLA-A等位基因Α*0201在高加索群体中的流行度为约 30% 至 50%(Player, et al., J Immunother.Emphasis TumorImmunol.19 (1996) 357-363)。人巨细胞病毒HCMV(=人疱疹病毒5，HHV_5)是最大的人病毒之一。它的基因组包含230，OOObp左右线性双链DNA且编码超过160种蛋白质(Davison，A.J.，et al., J.Gen.Virol.84 (2003) 17-28)。CMV已经进化成为人基因组的极端寄生物，而且它是一种有力的免疫原，触发来自免疫系统所有分支的强免疫应答。这种病毒表现为人免疫系统已知的免疫显性最高的抗原之一，而且刺激程度空前的⑶8+-T细胞应答。CMV “潜伏”依赖于CMV病毒的慢性免疫遏制，而非病毒转录样式的改变(Moss&Khan, Human Immunology65 (2004) 456-464)。⑶8+-T细胞免疫应答并非均匀针对所有CMV蛋白，而是有聚焦的。CMV蛋白pp65和 IE-1 是主要革巴物(McLaughlin-Taylor, E.，et al.，].Med.Virol.43 (1994) 103-110 ；Moss&Khan, Human Immunology65 (2004) 456-464)。CMV特异性T细胞的真实频率很高，各肽的频率的数量级高达总CD8+-T细胞全集的 I 至 2%(Moss&Khan, Human Immunology,见上文；Wills,M.R., et al., J.Virol.70( 1996)7569-7579)。CMV特异性⑶8+-T细胞应答随年龄显著升高，而且总⑶8+-T细胞库中超过10%频繁有各 HLA 肽四聚体染色(Khan，N.，et al.，J.1mmunol.169 (2002) 1984-1992)。健康老年供体中的总⑶8+-T细胞应答可占⑶8+-T细胞全集的大约50%。巨大的CD8+-T细胞扩增常常是在克隆方面很受局限的，而且估算CMV是随衰老在外周血在看到的克隆⑶8+-T细胞扩增中的至少30%的原因。超过60岁的CMV血清阳性供体中的总⑶8+-T细胞计数高达CMV血清阴性同龄组的两倍(Looney，R.J.，et al.，Clin.1mmunol.90 (1999) 213-219)。Mottez 等人(Eur.J.Tmmunol.21( 1991 )467-471 )；Godeau 等人(J.Biol.Chem.267(1992) 24223-24229)和 Mage 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.89 (1992) 10658-10662)报告了可溶性HLA和β 2-微球蛋白的融合物。Mottez等人(J.Exp.Med.181 (1995) 493-502)报告了病毒衍生肽与可溶性HLA和β 2-微球蛋白的融合物。Dal Porto等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90 (1993)6671-6675)报告了免疫球蛋白重链与可溶性HLA和共表达β 2-微球蛋白的融合物。Robert等人(Eur.J.1mmun.30(2000)3165-3170)记载了化学偶联至Fab的生物素化肽-可溶性HLA和β-2-微球蛋白与链霉亲合素的四聚体复合物。Robert等人(Cancer Immunityl(2001)2)报告了化学偶联的Fab及病毒衍生肽与可溶性HLA和β 2-微球蛋白的融合物。Greten等人(J.1mmunol.Methods271 (2002) 125-135)报告了病毒衍生肽与可溶性HLA和β 2-微球蛋白对鼠单克隆抗体重链的融合物。Lev等人(J.1mmunol.169(2002)2988-2996)；Lev 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.101 (2004)9051-9056)和 Novak 等人(Int.J.Cancerl20 (2006)329-336)报告了没有肽的scFv融合物的大肠杆菌表达、体外重折叠和肽加载。Mous等人(Leukemia20 (2006) 1096-1102)报告了加载有肽且偶联至融合有链霉亲合素的Fab或scFv抗体的生物素化可溶性MHC的使用。在W02005/099361中报告了具有经修饰β 2_微球蛋白的MHC I类肽-抗体缀合物。W02005/099361中报告的例示性缀合物是通过体外缀合MHC复合物(HLA)的α链或通过同一细胞中来自分开的基因的共表达而获得的。在US2004/0091488中报告了主要组织相容性复合物I类抗原及特定载体分子的抗原构建物。本文中报告了缺乏铰链区的融合多肽。专利技术概述本文中报告一种用于重组生产复合物的方法以及该复合物自身，其中该复合物包含特异性结合靶抗原的抗体衍生部分(作为第一部分)和共价连接至MHC I类蛋白复合物的病毒衍生肽(作为第二部分)。凭借本文中报告的复合物，通过给个体现有的、循环中的病毒特异性细胞毒性T细胞(Τ记忆细胞和/或T效应细胞)装饰(通过连接至MHC I类蛋白质复合物的病毒衍生肽)模拟急性病毒感染的MHC I类复合物，能将这些细胞引导至表达靶抗原(即复合物的抗体衍生部分特异性结合的靶抗原)的细胞。本文中报告的一个方面是一种用于在真核细胞中重组生产复合物的方法，该复合物包含:i) β 2-微球蛋白和I类MHC分子胞外域α 1、α2和α3的融合多肽，ii) 一对各自包含抗体铰链区的二硫化物连接的多肽链，和iii)至少一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，该方法包括下述步骤:i)培养包含一种或多种编码该复合物的核酸的真核细胞，并ii)自该细胞或培养基回收该复合物，其中该复合物包含β 2-微球蛋白和I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3的正好一条融合多肽。在一个实施方案中，该复合物包含正好一条MHC衍生多肽或正好一条包含MHC衍生分子的融合多肽。在一个实施方案中，在培养基中以lmg/ml或更多的浓度获得该复合物。在一个实施方案中，在培养基中以4mg/ml或更多的浓度获得该复合物。在一个实施方案中，该真核细胞为哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞为人胚肾细胞或中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞或小鼠骨髓瘤细胞。在一个实施方案中，该融合多肽以N至C端方向包含β 2-微球蛋白和相对发生频率小于1%的I类MHC分子的胞外域α 1、α 2和α 3。在一个实施方案中，该融合多肽包含T细胞应答引发肽、β 2-微球蛋白和相对发生频率为1%或更多的I类MHC分子的胞外域α 1、α 2和α 3。在一个实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于在真核细胞中重组生产复合物的方法，该复合物包含：i)β2?微球蛋白和I类MHC分子胞外域α1、α2和α3的融合多肽，ii)一对自抗体铰链区衍生的二硫化物连接的多肽链，和iii)至少一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，该方法包括下述步骤：?培养包含一种或多种编码该复合物的核酸的真核细胞，并?自该细胞或培养基回收该复合物，其中该复合物包含β2?微球蛋白和I类MHC分子胞外域α1、α2和α3的正好一条融合多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.06.22 EP 11171027.31.一种用于在真核细胞中重组生产复合物的方法，该复合物包含:i) β 2-微球蛋白和I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3的融合多肽，ii) 一对自抗体铰链区衍生的二硫化物连接的多肽链，和iii)至少一对抗体轻链可变域和抗体重链可变域，该方法包括下述步骤: -培养包含一种或多种编码该复合物的核酸的真核细胞，并 -自该细胞或培养基回收该复合物， 其中该复合物包含β 2-微球蛋白和I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3的正好一条融合多肽。2.依照权利要求1的方法，特征在于在培养基中以lmg/ml或更多的浓度获得该复合物。3.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于该真核细胞为哺乳动物细胞。4.依照权利要求3的方法，特征在于该哺乳动物细胞为人胚肾细胞或中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞或小鼠骨髓瘤细胞。5.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于该融合多肽以N至C端方向包含β2-微球蛋白和相对频率小于1%的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3。6.依照权利要求1至4任一项的方法，特征在于该融合多肽包含T细胞应答引发肽、β 2-微球蛋白和相对频率为1%或更多的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3。7.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于该自抗体铰链区衍生的二硫化物连接的多肽链i)通过一个或多个二硫键连接，?)第一二硫化物连接的多肽链以N至C端方向包含免疫球蛋白轻或重链可变域、免疫球蛋白轻或重链恒定域、和抗体重链铰链区多肽，且第二二硫化物连接的多肽链包含抗体重链铰链区多肽。8.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于该融合多肽i)共价结合至该二硫化物连接的多肽链之一的C端或N端，或ii)共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的关联重或轻链可变域互补的抗体可变域的N端,或iii)共价结合至与第一二硫化物连接的多肽链中包含的重或轻链恒定域互补的抗体恒定域的C端。9.依照权利要求6至8任一项的方法，特征在于该T细胞应答引发肽为病毒衍生肽。10.依照权利要求6至9任一项的方法，特征在于该融合多肽以N至C端方向包含 (i)具有选自SEQID NO:01至SEQ ID NO:09的氨基酸序列的病毒衍生肽， (ii)具有选自SEQID NO:16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第一接头肽， (iii)具有SEQID NO:10的氨基酸序列的β 2-微球蛋白， (iv)具有选自SEQID NO: 16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第二接头肽， (V)具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的I类MHC分子胞外域α 1、α 2和α 3，和 (vi)具有选自SEQ ID NO: 12，16，17，18，21，22和23的氨基酸序列的第三接头肽。11.依照前述权利要求任一项的方法，特征在于第一二硫化物连接的多肽链和第二二硫化物连接的多肽链包含i)包含选自SEQ ID NO:31,32和33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和包含选自SEQ ID NO:34,35和36的氨基酸序列的人IgGlCH3域。12.依照权利要求10至11任一项的方法，特征在于该复合物包含i)具有SEQID NO:21的氨基酸序列的第一接头肽，和/或ii)有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的第二接头肽，和/或iii)具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的第三接头肽，和/或iv)具有SEQ ID NO:32或33的氨基酸序列的人IgGlCH2域，和/或V)第一二硫化物连接的多肽中具有SEQ IDNO:35的氨基酸序列的人IgGlCH3域和第二二硫化物连接的多肽中具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的人IgGlCH3域。13.一种复合物，特征在于它包含 -一条融合多肽，其以N至C端方向包含 (i)β 2-微球蛋白，和 (ii)相对频率小于1...

【专利技术属性】
技术研发人员：H诺特根，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
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