一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法，该方法是利用pAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H，将两个表达载体pAUR123-PqDS和pAUR123-PqD12H转化到同一个酿酒酵母菌中获得重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H，从而实现在酿酒酵母菌中表达原人参二醇。本发明专利技术利用酿酒酵母合成原人参二醇，合成效率高，生产周期短，纯化容易，生产成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及西洋参基因PqDS和PqD12H，两种重组的酵母菌表达质粒pAUR123_PqDS和pAUR123_PqD12H，一种可合成原人参二醇的重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS-PqD12H 及其制备方法。
技术介绍
人参和西洋参中的主要成分均是人参皂苷，人参皂苷具有多种药理活性，如抗癌、抗疲劳、抗衰老和抗糖尿病等。近年来通过发根农杆菌转化人参组织细胞获得的人参发根，生长速度快，遗传和生物合成性状稳定，因此被认为是最具潜力的人参皂苷生产途径。然而，发根中皂苷含量较低，成为其工业化生产的主要瓶颈之一。通过代谢工程手段，基于人参皂苷生物合成途径，来提高人参发根皂苷的生物合成水平，是解决这一问题的有效手段。人参皂苷生物合成途径和人参皂苷生物合成关键酶基因的克隆是现阶段的研究热点。目前认为人参皂苷是先经由异戊二烯途径合成2，3-氧化角鲨烯，然后2，3-氧化角鲨烯在经由后续步骤的羟基化、糖基化修饰最终生成各种人参单体皂苷。2，3_氧化鲨烯是留醇和三萜等代谢产物生物合成的共同前体，也是异戊二烯途径的终产物。其生物合成路线为MVA途径生成的IPP及其异构化的DMAPP在牛儿基焦磷酸合成酶(GPS)作用下首先形成牛儿基焦磷酸(GPP)，接着利用法尼基焦磷酸合成酶(FPS)转化成法尼基焦磷酸(FPP)，又在鲨烯合成酶(SS)等的作用下合成鲨烯，然后经鲨烯环氧酶(SE)催化转变为2，3_氧化鲨烯。2，3-氧化鲨烯 在环化酶的作用下生成植物留醇和三萜类骨架。具体路线(1)2，3_氧化鲨烯在环阿桥醇合成酶(CAS)的作用下合成环阿桥醇，再经过一系列的催化反应生成植物留醇；(2)2，3_氧化鲨烯在达玛烯二醇合成酶(DS)的作用下合成达玛烯二醇，生成的达玛烯二醇在酶的进一步的催化作用下将会合成具有生理活性的各种单体皂苷。细胞色素P450(CYP450)是一类超基因家族编码的含有血红素的氧化酶类，分布于各种需氧生物体内，如植物、动物、真菌以及细菌等。在人参皂苷的合成途径中，P450对人参皂苷碳环骨架进行羟基化、氧化等复杂修饰作用，是人参皂苷合成途径中最为复杂的过程，最终决定人参皂苷单体的多样性。研究表明，在人参皂苷的合成途径中P450基因具有催化达玛烯二醇C-12位羟基化生成原人参二醇的原人参二醇合成酶(D12H)的功能。如何从P450家族众多基因中找出参与人参皂苷生物合成的基因并鉴定其功能，是通过生物工程合成重要药理作用的稀有人参皂苷的瓶颈。目前，萜类的代谢工程研究常在大肠杆菌和酵母菌中进行基因操作。在大肠杆菌中，萜类环化酶基因表达及萜类化合物的生产受到诸多因素的限制。首先，体内异戊二烯合成前体物质的缺乏是一个重要的制约因素，其次，环化酶表达水平低下是限制萜类产量的另一重要因素。与大肠杆菌相比较，酵母表现出更活跃的异戊二烯代谢功能，基于以上分析及食品安全方面考虑，因此选取酿酒酵母作为宿主菌。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，是一种在酿酒酵母菌中体外表达原人参二醇的方法，从而克服了西洋参中原人参二醇合成效率低，生产周期长，提取纯化困难等方面的问题。原理为酿酒酵母中天然存在2，3-氧化角鲨烯，转入西洋参的达玛烯二醇合成酶和原人参二醇合成酶基因后，表达生成的达玛烯二醇合成酶可直接催化酵母中的2，3-氧化角鲨烯生成达玛烯二醇，原人参二醇合成酶可催化达玛烯二醇生成原人参二醇。本专利技术中用到的西洋参中的基因PqDS和PqD12H为 申请人:在西洋参中首次，获得发现并克隆的两个与原人参二醇生物合成有关的新基因，现已发表在GeneBank上，基因登陆号为 PqDS (KC316048)和 PqD12H (JX569336)。本专利技术利用pAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123_PqDS和pAUR123-PqD12H,将两个表达载体pAUR123_PqDS和pAUR123_PqD12H转化到同一个酿酒酵母菌中获得重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS_PqD12H，从而实现在酿酒酵母菌中表达原人参二醇。本专利技术的有益效果:本专利技术利用酿酒酵母合成原人参二醇，合成效率高，生产周期短，纯化容易，生产成本低。【附图说明】图1是西洋参基因PqDS PCR扩增后电泳图。图2是西洋参基因PqD12H PCR扩增后电泳图。图3是重组质粒pAUR123_PqDS的酶切鉴定图。图4是重组质粒pAUR123_PqD12H的酶切鉴定图。图5是重组工程菌CICC-pAUR123-PqDS_PqD12H的菌落PCR鉴定图。图6是原人参二醇标准品的高效液相检测图。图7是空白对照组酿酒酵母菌菌液提取物的闻效液相检测图。图8是重组工程菌CICC-pAUR123-PqDS_PqD12H菌液的高效液相检测图。【具体实施方式】本专利技术是利利用pAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123_PqDS和pAUR123_PqD12H，将两个表达载体pAUR123_PqDS和pAUR123_PqD12H转化到同一个酿酒酵母菌中获得重组酿酒酵母菌CICC-pAUR123-PqDS_PqD12H，从而实现在酿酒酵母菌中表达原人参二醇。pAURl 23-PqDS 和 pAUR123_PqD12H 表达载体的构建1、引物的设计与合成(1) PqDS引物的设计与合成根据NCBI已发表的人参DS基因序列号⑶183405以及三七DS已发表基因序列号KC953035和Panax vietnamensis中已发表的DS基因序列号KF306328三个基因的保守区，通过Primer5.0设计简并引物。上下游引物分别为引物DS-F和引物DS-R。分别为DS-F:5> -RTKGCAGCAGBAATGGTGTT-3’ ；DS-R: 5，-GTDGGGWTGTAGABGAATCDGA-3，。(2) PqD12H引物的设计与合成根据NCBI已发表的人参P450基因序列号JN604536以及番茄中CYP85A1家族的P450已发表基因NM001247334和拟南芥中的CYP85A1家族P450已发表基因NM203133三个基因的保守序列区，通过软件Primerf.0设计简并引物。上下游引物为引物P450-F和引物P450-R。分别为P450-F:5’-RCAGYAGCAATGBTGTTCDT-3’ ；P450-R:5’-TYHATTGTGGGGATVTAGA-3’。引物的合成，由大连宝生物公司进行。(其中R = A / G，Y = C / Τ,Μ = A / C，K=G / T,S = C/G,ff = A/ T,H = A / C / Τ, B = C / G / Τ, V = A / C/G，D = A/G/T, N=A / C / G/T)2、P qDS和PqD12H基因的扩增以西洋参发根为原材料，按照RNA提取试剂盒的操作说明提取西洋参的总RNA，经反转录后作为模板，分别以设计的DS-F、DS-R ;P450-F、P45本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法，该方法是：利用pAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123?PqDS和pAUR123?PqD12H，将两个表达载体pAUR123?PqDS和pAUR123?PqD12H转化到同一个酿酒酵母菌中获得重组酿酒酵母菌CICC?pAUR123?PqDS?PqD12H，从而实现在酿酒酵母菌中表达原人参二醇。

【技术特征摘要】
1.一种利用酿酒酵母合成原人参二醇的方法，该方法是:利用PAUR123DNA质粒为穿梭载体，能够存在于大肠杆菌和酿酒酵母菌中，并且具有不同的筛选标记的特性，分别构建PqDS和PqD12H的表达载体pAUR123_PqDS和pAUR123_PqD12H，将两个表达载体pAURl23-PqDS...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵寿经，王雪松，钱延春，王乐，安岩，郝东云，梁彦龙，徐立新，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：