一种雷公藤红素衍生物的制备方法及其产品和应用技术

本发明专利技术提供一种雷公藤红素衍生物的制备方法及其产品和应用，该制备方法以雷公藤红素为微生物代谢药物，通过特殊诱导子对微生物代谢雷公藤红素，同时得到多种、高产率的基于雷公藤红素的羟基、还原或羧基化等取代修饰的雷公藤红素衍生物。本发明专利技术方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤红素衍生物，且制备的雷公藤红素衍生物具有高效、低毒等特点，能够实际地用于肿瘤、病毒性疾病和神经损伤性疾病的治疗，为雷公藤红素衍生物提供了广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
—种雷公藤红素衍生物的制备方法及其产品和应用【
】本专利技术涉及一种雷公藤红素衍生物的制备方法及其产品和应用。【
技术介绍
】卫矛科植物雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.F.),收载于《滇南本草》,其产地主要分布在中国南部，包括浙江、湖南、安徽、云南、福建和台湾等地，其中以福建泰宁产的雷公藤质量为最优[1]。而雷公藤红素(celastrol, CS)，属醌甲基三萜类化合物，是雷公藤主要的活性成分之一，其在抗癌、抗炎、特别是治疗神经系统疾病包括:阿尔兹海默病(早老性痴呆，AD)、帕金森病(PD)、亨延顿氏退行性疾病(HD)和脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化(ALS)疾病等方面表现出了突出的药理活性，特别是对“全长变异亨延顿神经元细胞显型的逆转作用十分突出，其对其聚合谷氨酸调节积累的半数抑制率为(IC5(i=2.5um)，这一抑制率与美国国立神经疾病研究所(NINDS)，所列出的全部1040个治疗HD的药物中排列于前10位，而在另一方面，雷公藤红素作为有效的蛋白酶体抑制剂，通过抑制伴侣蛋白(Hsp90)表达，发挥诱导肿瘤凋亡，显示了非常突出的抗肿瘤作用，为此，雷公藤红素在抑制肿瘤和神经系统保护的药物开发方面，显示了巨大的应用前景。然而，雷公藤红素极低的水溶性所引起制剂困难、对酸碱敏感而引发的分解、还原和重排，聚合不稳定性等都限制了其研发进程和临床应用(引用文献如下:孙红莉.雷公藤红素衍生物的化学合成及其活性研究[博士论文].暨南大学，2010)。鉴于上述问题，国内外学者成功运用化学法对雷公藤红素进了多种修饰改造，其中化学合成法合成的衍生物包括:二氢雷公藤红素及多种雷公藤红素类似物(公开文献如下:(Nagase M, Oto J, Sugiyama S，et al.Apoptosis induction inHL_60cells and inhibition of topoisomerase II by triterpene celastrol.Bioscience,biotechnology, and biochemistry, 2003, 67(9):1883-1887)、(Devlin, JP.Derivatives of pentacyclic nortriterpene quinone methides as compounds usefulin the treatment of inflammatory neurodegenerative and neoplastic diseases, USpatent 2004/0220267 Al, 2004-11-04))，雷公藤红素有机酯类衍生物(雷公藤红素甲酯、雷公藤红素乙酯、雷公藤红素丙酯、雷公藤红素丁酯、雷公藤红素卞酯、14N-甲基-哌嗪酸-雷公藤红素酯、3-乙基雷公藤红素、3- 丁基雷公藤红素、3-丙基雷公藤红素、3-异丁基雷公藤红素、3-川芎嗪酸雷公藤红素、28-川芎嗪酸雷公藤红素、a-硫辛酸雷公藤红素酯(公开专利为:王玉强，孙红莉，徐立朋，等。一种雷公藤红素衍生物及其用途，中国专利20101015042 8.6.2010-04-23)、雷公藤红素磺酸钠类衍生物(2，3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素，2，3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素甲酯，2，3羟基-6-磺酸钠-雷公藤红素丁酯，2，3，7羟基-6磺酸钠-雷公藤红素，2-羟基-3乙酰基-6磺酸钠-雷公藤红素，2，3羟基-6磺胺-雷公藤红素甲酯)(公开专利为:(Zeng JF, Pan JF1Li BY etal.Water-soluble triterpenephenol compound having antitumor activity and thepreparation thereof, US patent 2010/0267983, 2010-10-21), (Zeng JF, Pan JF, Li BYet al.Water-soluble triterpenephenol compound having antitumor activity andthe preparation thereof, European patent，EP，2012/2213679 BI，2012-06-06))和雷公藤红素酰胺类衍生物(28- (4，-甲氧基)-苄基酰胺雷公藤红素，28-苄基酰胺雷公藤红素，28- (3，-吡啶)甲酰胺基雷公藤红素，28-异丙基酰胺雷公藤红素、28- (N-甲基)-甲酰胺雷公藤红素，28-吡咯烷酰胺雷公藤红素、28-甲氧基乙基酰胺雷公藤红素、28-吗啉酰胺雷公藤红素、28-N-甲基酰胺雷公藤红素、雷公藤红素28-N-甲基哌嗪酰胺、雷公藤红素苯甲酸酯、雷公藤红素异丙酯)(公开专利为:Ze，ev A, R, Anindita, B, Nicholas DP, C etal.Compositions and methods for inhibiting growth and metastasis melanoma.USpatent 2011/7888355 B2，2011-02-15)。虽然化学修饰为大规模制备雷公藤红素相关衍生物提供了广阔的前景，但是但化学合成法存在得率低、选择性差、副产品多、过程较繁杂等缺点，而且目前大多数衍生物的作用与雷公藤红素相比，还相对较弱，为此，具有一定的局限性。由于雷公藤红素水溶性极差，其在体内发挥最用的应该以其体内代谢产物为主，虽然雷公藤红素体内代谢产物已经部分阐明，但是利用化学方法直接得到与雷公藤代谢相同的成分，比较少，而在另一方面，利用具有仿生代谢能力的微生物直接通过微生物特殊的酶促作用直接转化生物雷公藤红素产生多种体内代谢、减毒后的雷公藤红素的衍生物已经取得了很好的效果，但该代谢的方法在雷公藤红素方面的应用极少，目前尚未见到系统的报道结果。因此，需要利用生物工程的这项技术，以此得到更多的雷公藤红素衍生物。【
技术实现思路
】本专利技术要解决的技术问题之一，在于提供一种雷公藤红素衍生物的制备方法，该方法绿色环保、选择性强、产率高，能够大规模利用微生物制备雷公藤红素衍生物。本专利技术是这样实现上述技术问题之一的:一种雷公藤红素衍生物的制备方法，包括以下步骤:步骤一:取保存于4°C、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25°C恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107~108个/mL，既得种子孢子液；步骤二:以lOOmL，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至6.0，温度30°C ±1°C，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1~4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按I~IOug的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤红素衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5~3%时,停止培养,过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心IOmin去除沉淀既得到发酵提取液；步骤三:将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：取保存于4℃、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支，置于25℃恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至107～108个/mL，既得种子孢子液；步骤二：以100mL，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至6.0，温度30℃±1℃，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1～4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按1～10ug的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤红素衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5～3%时，停止培养，过滤后收集菌丝体，然后将滤液于8000r/min,离心10min去除沉淀既得到发酵提取液；步骤三：将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1：3～1：10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣；步骤四：将经过步骤三处理所得的残渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为：5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚：二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷：乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22μm的有机膜过滤后，得到分离液；步骤五：将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤红素衍生物洗脱液，减压蒸 去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤红素衍生物。...

【技术特征摘要】
1.一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一:取保存于4°c、土豆斜面培养基培养的、转化菌种一支,置于25°C恒温培养箱中培养7天后，以适量无菌水将斜面上的孢子充分吹打下来，使单孢子悬液的浓度调整至IO7~IO8个/mL，既得种子孢子液； 步骤二:以100mL，5mL的接种量，在土豆液体培养基上接种步骤一所得孢子液，在pH至 6.0，温度30°C 土 TC，振荡速度为200r/min条件下培养12h后；按0.1~4ug的接种量，加入各种不同比例的联合诱导子，继续培养12h后，再按I~IOug的接种量加入雷公藤红素，然后继续培养5天，每天检测各种雷公藤红素衍生物的含量和转化率，当产物转化率低至0.5~3%时,停止培养,过滤后收集菌丝体,然后将滤液于8000r/min,离心IOmin去除沉淀既得到发酵提取液； 步骤三:将步骤二所得提取液过滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌丝体则用重量比为1:3~1:10的乙酸乙酯超声提取30min，然后滤去菌丝体，所得滤液与萃取液合并，既得分离提取液，提取液浓缩至干，得到提取后残渣； 步骤四:将经过步骤三处理所得的残渣，用Img:1~IOmL的比例用丙酮溶解后，采用硅胶拌样后挥干，称取20倍于样品量的硅胶，使用湿法进行填柱和上样；首先用5倍柱体积的100%石油醚将样品中低极性油类物质洗脱干净，然后依次用体积比为:5:2，2:3，2:5，0:5的石油醚:二氯甲烷的洗脱液，体积比为10:0，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的二氯甲烷:乙酸乙酯洗脱液，以及100%乙酸乙酯洗脱液，依次对柱子进行洗脱，TLC控制收集主馏分，最后使用旋转蒸发仪将各个馏分的流动相蒸干后，用适量色谱纯的甲醇溶解后，用0.22 μ m的有机膜过滤后，得到分离液； 步骤五:将经过步骤四处理所得的分离液，采用高效液相半制备法分离纯化，HPLC梯度洗脱法控制收集不同的雷公藤红素衍生物洗脱液，减压蒸去溶剂后，用甲醇结晶后所得到的化合物，即为所述的雷公藤红素衍生物。2.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于:所述土豆培养基为:土豆200g/L，葡萄糖20g/L ;配置时将土豆去皮后将其切成小块，加水加热煮沸30min，过滤，取滤液定容至1L，加入葡萄糖20g，搅拌溶解后，121°C灭菌30min，即得； 斜面培养基为:取上述土豆培养基1L，加入琼脂粉各20g，加热溶解后分装于玻璃试管中，于121 °C下灭菌30min后取出，倾斜45度，静置、冷却既得。3.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于:所述转化菌种为下述微生物中任意一种: 短刺小克银汉霉(Cunninghamella blakesleana)AS3.970;AS3.153;AS3.910 ；AS3.954, AS3.2016 ;AS3.2017 ;AS3.2018 ;AS3.3401;或者刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)AS3.154;AS3.952;AS3.953;AS3.1969;AS3.1970;AS3.1971;AS3.1977;AS3.1978;AS3.1979;AS3.1980;AS3.1981;AS3.1987;AS3.1988;AS3.1989;AS3.1990;AS3.2000;AS3.2004;AS3.2005;AS3.2006;AS3.2011;AS3.2015;AS3.2473;AS3.2474;AS3.2475;AS3.2716 ;AS3.400;或者雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans.) AS3.156;AS3.1207;AS3.1659;AS3.2028;AS3.2031;AS3.2032;AS3.2033;AS3.2041;AS3.2476;AS3.2477;AS3.2717 ;AS3.3402 ;AS3.2476;小克银汉霉 CFCC5029;或者 Cunninghamella echinulatavar.elegans (Lendner)Lunn et Shipton, teleomorph ATCC9245 ；ATCC8688a ；ATCC8983 ；或者 Cunninghamella echinulata(Thaxter)Thaxter var.echinulata, teleomorphATCC11585a；ATCC36190 ；ATCC11585b ；ATCC9244 ；或者 Cunninghamella echinulatavar.elegans(Lendner)Lunn et Shipton, teleomorph ATCCl1064 ；ATCC10028a ；或者Cunninghamella elegans ATCC36112 ；ATCC26269 ；ATCC10028b ；黑曲霉 Aspergillusniger AS3.40;AS3.315;AS3.316;AS3.350;AS3.429;AS3.739;AS3.879;AS3.939;AS3.940;AS3.1858;AS3.2931 ;AS3.3882 ;AS3.3883 ;AS3.4303 ; AS3928 ; AS3.4304 ;AS3.4309; AS3.4463;AS3.4304;AS3.4523 ;黄曲霉、刺囊毛霉、细孢毛霉、链格孢、微紫青霉和荨麻青霉。4.如权利要求1所述的一种雷公藤红素衍生物的制备方法，其特征在于:所述的联合诱导子为下述三组物质中的至少两组中的任意一种物质组成: A组:Al为α -环糊精，Α2为β -环糊精，A3为2，6_ 二甲基-β -环糊精，Α4为2-羟丙基-β -环糊精，Α5为甲基化-β -环糊精、Α6为羟乙基-β -环糊精，Α7为葡萄糖-β -环糊精，AS为磺丁基-β -环糊精，Α9为Y -环状糊精，AlO为羧甲基-β -环糊精； B组:B1为茉莉酸甲酯，B2为水杨酸，B3为壳聚糖，B4为茉莉酸，B5为真菌聚糖类，B6为β -葡聚糖，Β7...

【专利技术属性】
技术研发人员：张景红，谢深霞，叶龙飞，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：