本发明专利技术提供一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体（简称：β-葡萄糖苷酶CLEAs）催化合成红景天苷的工艺，其中，在红景天苷合成阶段中：反应体系为1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4-二氧六环/缓冲溶液，仿水溶剂为乙酸乙酯，β-葡萄糖苷酶CLEAs的单位酶活为1.3~1.6U/ml，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙酸乙酯的体积和与1,4-二氧六环体积比为2:3~3:2，缓冲溶液的体积分数为12~18%；反应温度为48~52℃，反应5~9d。本发明专利技术能够大幅提高产物红景天苷的浓度，且可保持较高的β-葡萄糖苷酶CLEAs残余相对酶活。
【技术实现步骤摘要】
一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺
本专利技术属于酶催化合成红景天苷领域，尤其是一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体(简称:β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成红景天苷的工艺。
技术介绍
红景天苷是具有特殊生理功能的化合物，它在抗细胞缺氧、抗肿瘤、增强机体免疫力等方面均有良好效果。由于生物合成红景天苷具有选择性高、反应条件温和、产物纯度较高、产品便于分离纯化等优点，因此受到普遍关注。鉴于酶催化合成红景天苷的反应时间比植物组织培养和细胞培养时间都要短很多，并且，反应过程无需昂贵的糖苷供体和催化剂，避免了化学合成繁琐的反应步骤，另外，反应完成后可以方便的从反应液中提取目标产物红景天苷，未反应的底物对羟基苯乙醇可再次循环使用，降低生产成本，因此，酶催化合成红景天苷为红景天苷批量生产具有非常大的经济意义和现实意义。 由于红景天苷在糖苷酶的存在下极易被水解，而生物合成红景天苷过程中所需的酶又需要水环境来保持其活性，即保持较高的红景天苷合成效率，因此，如何实现保持酶活性与抑制红景天苷水解的平衡点，成为了一大难题。陈磊在其硕士学位论文“西梅籽β_葡萄糖苷酶的分离纯化、性质及固定化研究”一文中提到了关于β -葡萄糖苷酶交联聚集体在合成红景天苷中的应用，其结论是:以β_葡萄糖苷酶交联聚集体为催化剂催化合成红景天苷的反应中，产物红景天苷的浓度大约为0.76 g/L，仅比采用粗酶粉催化合成红景天苷的产物红景天苷浓度高0.1 g/L。王梦亮等人于2009年发表了一篇“固定化β-葡萄糖苷酶催化合成红景天苷的研究”的文章，在1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(C4MIm WF6)离子液体/1，4- 二氧六环作为反应介质，C4MIm.PF6 /I, 4- 二氧六环为99% (ν/ν),经过条件优化后，红景天苷产物浓度可达18.57 g/L，此为现阶段国内外生物合成红景天苷领域红景天苷浓度可达到的最高值。但是，产物红景天苷的浓度依然较低，无法满足工业化生产对经济利益最大化的需求，并且，酶活回收率较低。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种能够大幅提高产物红景天苷浓度的β_葡萄糖苷酶交联聚集体(简称:β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成红景天苷的工艺，本专利技术反应过程无需昂贵的糖苷供体和催化剂，避免了化学合成繁琐的反应步骤，另外，反应完成后可以方便的从反应液中提取目标产物红景天苷，未反应的底物对羟基苯乙醇可再次循环使用，降低生产成本，同时解决了由于离子液体价格昂贵，离子液体的加入量在工艺中仍然很大，使得生产红景天苷的成本偏高等问题，因此，酶催化合成红景天苷为红景天苷批量生产具有非常大的经济意义和现实意义。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案:一种β_葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，包括β_葡萄糖苷酶交联聚集体的制备和红景天苷的合成两个阶段； β -葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段，包括以下步骤: (1)将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡； (2)再加入戊二醛； (3)向混合液中加入硼氢化钠，振荡后，300~500rpm离心5~IOmin,收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶交联聚集体； 红景天苷的合成阶段，包括以下步骤: (4)将β-D-葡萄糖和对羟基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交联聚集体的pH为5.5^6.5的缓冲溶液中，再加入1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、仿水溶剂和1，4- 二氧六环，形成1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1，4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，仿水溶剂为乙酸乙酯；(5)密封，保持温度为48~52°C，转速为245~255 rpm，反应5~9d，收集反应液； 其中，步骤(4)的1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1，4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β-D-葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1: f 1:3，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的单位酶活为1.3^1.6U/ml，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐与乙酸乙酯的体积和与1，4-二氧六环的体积比为2:3~3:2，缓冲溶液的体积分数为12~18%。步骤(1)中沉降剂为1，4-二氧六环，1，4-二氧六环与葡萄糖苷酶液的体积比为1.7: f 2.2:1，β-葡萄糖 苷酶液含葡萄糖苷酶1.5~2.5mg/ml ;步骤(2)中戊二醛的终浓度为38~43mM，交联时间为8~12min ;步骤(3)中硼氢化钠的终浓度为20~25 mM ; β -葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段整个反应过程的反应温度控制在4~6°C，pH为5.0-5.5。红景天苷合成阶段的步骤(4)中乙酸乙酯与1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐的体积比为50%~80%。本专利技术采用β_葡萄糖苷酶交联聚集体作为合成红景天苷的催化剂，在离子液体/有机溶剂体系中催化直接糖基化反应成功合成红景天苷。本专利技术的技术效果在于:(1)将产物红景天苷的浓度提高至21g/L以上；(2)采用β -葡萄糖苷酶交联聚集体作为催化剂，β-葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活高(反应后葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活也在84%以上)，制作简单，同时，β -葡萄糖苷酶交联聚集体通过离心即可实现高效回收，酶的回收作业简单、快捷；(3)本专利技术的β -葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺中，采用廉价的仿水溶剂(如:乙酸乙酯)来代替部分的离子液体，可在不影响产物红景天苷浓度的前提下(产物红景天苷的浓度可维持在21g/L以上)，大大降低生产成本；(4)本专利技术通过对β-葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段反应条件的优化，使得β-葡萄糖苷酶交联聚集体的酶活回收率也达到了 80%以上，大大降低了 β -葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段的酶活损失，从而，降低了合成一定量红景天苷的β -葡萄糖苷酶用量，进一步缩减生产成本。在酶催化合成红景天苷领域，由于红景天苷在糖苷酶存在下极易被水解的特性，使得提高产物红景天苷的浓度变得十分困难。本专利技术能够得到如此高的产物红景天苷浓度，不仅仅在于β-葡萄糖苷酶交联聚集体在离子液体/有机溶剂体系中的酶催化效率高；另外，仿水溶剂的选择也很重要，本 申请人:分别采用乙酸乙酯、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺作为仿水溶剂进行试验，发现仅乙酸乙酯(本申请采用乙酸乙酯作为仿水溶剂)可使得最终制得的反应液红景天苷浓度较高；还在于，本 申请人:进行无数次的试验，得到了红景天苷合成过程各个反应条件的较佳值，最终，才使得本专利技术的产物红景天苷浓度达到21 g/L以上，高于现有的国内外所报道的最高值(18.57g/L)，并且，β -葡萄糖苷酶交联聚集体的残余相对酶活也保持在较高的水平(85%以上)。再加上，本 申请人:通过对葡萄糖苷酶交联聚集体的制备过程中各个反应条件进行了优化，提高了 β-葡萄糖苷酶交联聚集体的酶活回收率。【具体实施方式】实施例1 β -葡萄糖苷酶交联聚集体(简称β -葡萄糖苷酶CLEAs)催化合成红景天苷的工艺，包括β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备和红景天苷合成两个阶段； β -葡萄糖苷酶CLEAs的制备阶段，包括以下步骤:(I)将1.7ml I, 4- 二氧六环加入Iml含β -葡萄糖苷酶2.5mg/ml的β -葡萄糖苷酶溶液中(1，4- 二氧六环与β -葡萄糖苷酶液的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β?葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，其特征在于：包括β?葡萄糖苷酶交联聚集体的制备和红景天苷的合成两个阶段；β?葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段，包括以下步骤：（1）将沉降剂加入β?葡萄糖苷酶溶液中，振荡；（2）再加入戊二醛；（3）向混合液中加入硼氢化钠，振荡后，300~500rpm离心5~10min，收集沉淀，即为β?葡萄糖苷酶交联聚集体；红景天苷的合成阶段，包括以下步骤：（4）将β?D?葡萄糖和对羟基苯乙醇溶解于含β?葡萄糖苷酶交联聚集体的pH?为5.5~6.5的缓冲溶液中，再加入1?丁基?3?甲基咪唑六氟磷酸盐、仿水溶剂和1,4?二氧六环，形成1?丁基?3?甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4?二氧六环/缓冲溶液反应体系，仿水溶剂为乙酸乙酯；（5）密封，保持温度为48~52℃，转速为245~255?rpm，反应5~9d，收集反应液；其中，步骤（4）的1?丁基?3?甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1,4?二氧六环/缓冲溶液反应体系中，β?D?葡萄糖与对羟基苯乙醇的摩尔比为1:1~1:3，1?丁基?3?甲基咪唑六氟磷酸盐的单位酶活为1.3~1.6U/ml?，?1?丁基?3?甲基咪唑六氟磷酸盐与乙酸乙酯的体积和与1,4?二氧六环的体积比为2:3~3:2，缓冲溶液的体积分数为12~18%。...
【技术特征摘要】
1.一种β-葡萄糖苷酶交联聚集体催化合成红景天苷的工艺，其特征在于:包括β -葡萄糖苷酶交联聚集体的制备和红景天苷的合成两个阶段；β -葡萄糖苷酶交联聚集体制备阶段，包括以下步骤: (1)将沉降剂加入β-葡萄糖苷酶溶液中，振荡； (2)再加入戊二醛； (3)向混合液中加入硼氢化钠，振荡后，300~500rpm离心5~IOmin,收集沉淀，即为β-葡萄糖苷酶交联聚集体； 红景天苷的合成阶段，包括以下步骤: (4)将β-D-葡萄糖和对羟基苯乙醇溶解于含β-葡萄糖苷酶交联聚集体的pH为5.5^6.5的缓冲溶液中，再加入1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、仿水溶剂和1,4-二氧六环，形成1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1，4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系，仿水溶剂为乙酸乙酯；(5)密封，保持温度为48~52°C，转速为245~255 rpm，反应5~9d，收集反应液； 其中，步骤(4)的1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐/仿水溶剂/1，4- 二氧六环/缓冲溶液反应体系中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：石贤爱，薛原楷，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：
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