一种生产腺苷蛋氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种以腺苷为底物酶促生产腺苷蛋氨酸（SAM）的方法，利用管道连接装有固定化酵母细胞的生产三磷酸腺苷（ATP）的反应器，和装有SAM合成酶—树脂生产SAM的反应器，组成一套藕连循环反应系统，让反应液在两个反应器之间循环流动，反应液在ATP反应器生成ATP后，进入SAM反应器，在SAM反应器中，SAM合成酶及时利用消耗去反应液中的ATP，并生成的SAM；从SAM反应器流出的反应液再循环进入ATP反应器中，循环反应。成功地解决了固定化酵母生产ATP时产物抑制的问题，同时也解决了以ATP为原料生产SAM成本高的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种生产腺苷蛋氨酸的方法
本专利技术涉及生化药物生产工艺，特别是一种以腺苷为起始原料酶促生产腺苷蛋氨酸的方法。
技术介绍
腺苷蛋氨酸（SAM）是存在于人体所有组织和体液中的一种生理活性分子，化学结构式如下：腺苷蛋氨酸（SAM）SAM主要用于治疗肝硬化前和肝硬化所致肝内胆汁郁积，妊娠期肝内胆汁郁积，精神抑郁等疾病。腺苷蛋氨酸生产工艺的复杂性使德生产成本较高，价格昂贵严重限制了腺苷蛋氨酸在医疗和保健领域的广泛应用。因此，欧美科技界在腺苷蛋氨酸的稳定成盐和生产工艺方面申报了多项专利。药物原料市场上具有代表性的一些专利有：如美国专利6635615，5l0279l、4028183、4369l77、4764603等。SAM全球的需求每年为80-100吨。SAM主要生产厂商集中在德国和意大利，药用原料每千克约6000元人民币。国内已有开发研究工作，因发酵法的表达水平低，酶促转化法的酶和底物原料成本较高，所以SAM在我国原料生产至今未能大规模化，我国SAM主要依赖进口雅培公司生产的思美泰。目前腺苷蛋氨酸工业化生产工艺主要有酵母发酵法和酶促转化法两种，这两种方法都存在着不同的技术难点：酵母发酵法：国外多采用特殊培育的表达SAM的酿酒酵母菌株通过胞内表达制备SAM。国内有人研究出基因工程改构的酿酒酵母，发酵表达SAM，但目前表达最高的也只达到8g/L发酵液，而且大多只完成发酵工艺的探索，用此法生产是在胞内表达，由于SAM的前体L-蛋氨酸需透过胞壁，且受胞内空间的限制所以表达产量很难提高，收率低，成本高，不适合大规模制备。酶促法：酶促法多以从啤酒酵母或大肠杆菌工程菌中提取纯化腺苷蛋氨酸合成酶，然后通过优化酶促反应条件来制备SAM，但是该法中是以纯化的游离态SAM合成酶为酶源，以腺苷三磷酸（ATP）为前体底物原料，因游离态SAM合成酶不能重复利用，且底物原料ATP价格昂贵，导致酶促法合成SAM成本很高，也不适合大规模工业化生产SAM。
技术实现思路
本专利技术提供一种以廉价的腺苷为起始原料制备腺苷蛋氨酸的方法。在本专利技术的一个优选实施方式中，本专利技术的方法解决酶促法中游离酶的不能重复利用及底物原料成本较高所导致的SAM生产成本较高，而无法工业化大规模生产的问题。本专利技术是一种以腺苷为底物酶促生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）选择以腺苷为起始原料生产腺苷三磷酸的酵母菌株，采用固定化酵母技术得到包埋有酵母细胞的胶珠，装入柱或罐中制成生产ATP的反应器；（2）通过酶固定化技术，得到SAM合成酶与载体树脂交联形成固定化SAM合成酶，装入柱或罐中制成生产SAM的反应器；（3）生产ATP的反应器和生产SAM的反应器通过管道连接，让反应液在两个反应器中定向循环流动，反应液在ATP反应器生成ATP后，进入SAM反应器，在SAM反应器中，SAM合成酶及时利用反应液中的ATP，并生成SAM，从SAM反应器流出的反应液再循环进入ATP反应器中，在ATP反应器中添加包括腺苷及葡萄糖在内的底物原料。在本专利技术的一个优选实施方式中，所述的酵母菌株为保藏编号为CGMCCNO.7397。在本专利技术的另一个优选实施方式中，所述的包埋有酵母细胞的胶珠的工艺包括如下步骤：将海藻酸钙溶液与活化后的酵母细胞混合，通过蠕动泵滴入CaCl2溶液中，搅拌，固化，制得直径为4-6mm的酵母细胞固定化胶珠。在本专利技术的另一个优选实施方式中，所述的把包埋有酵母细胞的胶珠装入一个两端安装有过滤网的玻璃柱或反应罐中，制得ATP反应器。在本专利技术的另一个优选实施方式中，SAM合成酶与活化载体树脂交联制备成固定化酶树脂具体而言，利用发酵技术发酵，得到SAM合成酶大肠杆菌，通过破胞提取胞内的SAM合成酶，SAM合成酶与载体树脂交联制备成固定化酶—树脂。在本专利技术的另一个优选实施方式中，把固定化酶树脂装入一个两端安装有过滤网的玻璃柱或反应罐中，制得SAM反应器。在本专利技术的一个优选实施方式中，所属的初始反应液的包括七水硫酸镁1-3g/L，磷酸二氢钾40-60g/L，L-蛋氨酸10-20g/L，葡萄糖40-80g/L，腺苷10-20g/L。在本专利技术的另一个优选实施方式中，ATP反应器的反应条件为pH值6.5-7.0，温度33℃-35℃；SAM反应柱的反应条件控制为pH值7.0-7.5，温度36℃-38℃。在本专利技术的另一个优选实施方式中，所述的反应体系包括ATP配料罐，ATP反应器，SAM配料罐，SAM反应器，泵，管道，SAM储液罐，优选的，所述的反应体系的部件连接方式如图1所示。由于生成ATP和SAM的反应条件有所不同，可通过反应器保温夹层调节反应温度，通过配料罐调节pH值，还可通过配料罐补加底物，如在ATP配料罐中补加腺苷和葡萄糖，在SAM配料罐中补加L-蛋氨酸等以提高反应效率。待ATP反应器初始反应6-7小时后检测溶液中ATP的浓度，当浓度达到10-15g/L范围后，开启循环泵，将反应液循环至SAM配料罐调节pH值和温度，然后，循环至SAM反应器中开始酶促合成SAM，流出液循环至ATP反应器。在循环反应过程中根据SAM酶促反应情况向ATP配料罐和SAM配料罐中分别添加适量腺苷和L-蛋氨酸，待SAM反应器中SAM含量到达15-20g范围时，将料液循环到SAM储液罐中，加硫酸调pH值至3.0-5.0。即得SAM合成液，交下一步纯化工序；然后，在反应液储罐中加入下一批物料开始下一批反应生产。本专利技术的方法成功地解决了酶促合成ATP和SAM的底物抑制、产物抑制、产物分解及副产物重复利用等问题，同时也解决了生产SAM用ATP为底物原料，成本较高的问题，使SAM实现大规模工业化生产。附图说明图1：本专利技术反应体系示意图，其中1：ATP配料罐，2：ATP反应器，3：SAM配料罐，4：SAM反应器，5：泵，6：管道，7：SAM储液罐。微生物信息本专利技术的一个优选实施方式以及具体实施方式中所使用的酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNO.7397，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2013年4月1日，该保藏证明的原件用于申请中国专利2013103575631，申请日为2013年8月16日。具体实施方式：以下结合技术方案和附图详细叙述本专利技术的具体实施例。酵母菌株CGMCCNO.7973采用下述流程进行选育：土壤样品→→富集培养→→麦芽汁琼脂平板初选→→液体发酵复筛→→麦汁琼脂平板分离纯化→→产酶发酵培养→→腺苷转化试验→→中试试验。在显微镜下观察，该菌体细胞呈球形，端生芽殖，在固体培养基上，该菌菌落为乳白色，表面平滑，边缘整齐，经中国科学院微生物研究所鉴定为酿酒酵母。利用该菌株能够以腺苷为起始原料合成腺苷三磷酸。实施例一：1、ATP反应器的制备（1）酵母菌体细胞的发酵培养发酵培养基配方：葡萄糖50g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水硫酸镁2g/L,酵母膏5g/L，蛋白胨2g/L。配制好培养基后，加入发酵罐，进行连续流高密度发酵培养，待酵母菌菌体达到恒定浓度后，离心收获得到酵母菌菌体细胞。（2）酵母菌体细胞的固定化将浓度为40g/L的海藻酸钙溶液与活化后的酵母细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以腺苷为底物酶促生产腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）选择以腺苷为起始原料生产腺苷三磷酸的酵母菌株，采用固定化酵母技术得到包埋有酵母细胞的胶珠，装入柱或罐中制成生产ATP的反应器；（2）通过酶固定化技术，得到SAM合成酶与载体树脂交联形成固定化SAM合成酶，装入柱或罐中制成生产SAM的反应器；（3）生产ATP的反应器和生产SAM的反应器通过管道连接，让反应液在两个反应器中定向循环流动，反应液在ATP反应器生成ATP后，进入SAM反应器，在SAM反应器中，SAM合成酶及时利用反应液中的ATP，并生成SAM，从SAM反应器流出的反应液定期分出SAM后，再循环进入ATP反应器中，在ATP反应器中添加包括腺苷及葡萄糖在内的底物原料。

【技术特征摘要】
1.保藏编号为CGMCCNO.7397的酵母菌(Saccharomycescerevisiae)在制备腺苷蛋氨酸(SAM)中的应用，其特征在于，(1)以腺苷为起始原料，选择生产ATP的保藏编号为CGMCCNO.7397的酵母菌(Saccharomycescerevisiae)，采用固定化酵母技术得到包埋有酵母细胞的胶珠，装入柱或罐中制成生产ATP的反应器；(2)通过酶固定化技术，得到SAM合成酶与载体树脂交联形成固定化SAM合成酶，装入柱或罐中制成生...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨西宁，渠桂荣，郭海明，邢善涛，夏然，王秀强，王东超，蔡玉瑛，
申请(专利权)人：新乡拓新生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：