基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因进行电化学检测的方法，在洗净的金电极上滴加适体片段Co3S，冰箱中过夜后取出封闭，在金电极上滴加适体片段Co3B和待测样品，37℃下反应完后，再滴加链酶亲和素溶液温育，然后加入环化DNA溶液温育，滚环扩增，加入检测探针杂交，进行DPV信号检测。本发明专利技术首次利用滚环扩增与超分子适体对可卡因进行电化学检测，极大提高了可卡因检测的灵敏度和特异性，使得检测的线性范围达到10～500nM。使用相同体积和相同浓度的链酶亲和素溶液和环化DNA，将识别元件和放大元件分开，仅利用其桥接作用，减少了空白信号，极大提高了检测的灵敏度和线性范围。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可卡因的检测方法，尤其涉及一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因进行电化学检测的方法，属于生物检测领域。
技术介绍
可卡因(cocaine)是古柯叶中所含的主要生物碱，又名古柯碱。古柯叶中有很多生物碱，主要有可卡因、芽子碱(ecgonine)、苯甲酰芽子碱、肉桂酸可卡因和N-甲醛可卡因等物质，对中枢神经系统有严重的毒害作用。目前对可卡因检测的方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、薄层色谱法(TLC)、电子鼻、电子俘获、显微拉曼技术(MRS, micro raman spectroscopy)、X射线探测技术和热中子断层扫描等。这些技术的检测灵敏度高，但检测步骤繁琐、设备昂贵，测试程序复杂、耗时，成本较高，需要专业技术人才，不适合现场快速筛查使用。针对缉毒工作的实际需求，需要开发灵敏度高、选择性好、便携式、能耗低和易操作的智能化毒品快速检测产品，以达到灵敏和快速的检测目的。目前国内外对吸毒人员快速现场筛查和液体中毒品检测的主要技术是各种基于免疫反应的产品，主要有酶免疫分析和免疫胶体金技术。前者涉及酶反应，检测步骤繁琐，试剂稳定性差，通常不能长时间保存。后者简便，快速，但误判率高，灵敏度较低，只能进行定性测试，难以进行质量控制，即使是同一批生产的试剂，也很难保证每个试剂的同一性。因此，一般只能用于定性试验，不能进行定量分析。滚环扩增技术(RCA)是一种在恒温下直接扩增环状单链DNA的方法。不仅能实现靶序列的信号放大，而且扩增是在等温下实现的，反应条件温和，其灵敏度可达到I个拷贝的核酸分子。RCA技术的优势是:高灵敏度、高特异性、简单、易操作、多元性、高通量。适配体(Aptamer)是从IO15的随机序列的DNA或RNA库中通过指数富集的系统分子进化方法(简称SELEX)筛选出来的，能够特异性地与靶标分子结合，从而特异性地识别靶标分子。适配体可以用于包括蛋白质、小分子、重金属离子、细胞和病毒等的各种各样的生物分子的检测。与传统的抗体相比，适配体在多个方面具有显著的优越性。适配体稳定性高、价格低廉、不同批次产品质量完全相同，而且具有与抗体相当甚至更好的专一性和亲和性。目前利用适配体进行可卡因检测的方法，主要是使用一段适配体，或使用将一段分开成两段的适配体进行可卡因的检测。在具体的检测方法上主要是利用荧光淬灭、酶催化的颜色反应、电化学或纳米金颜色反应进行可卡因的检测。这些方法的检测线性范围在0.1μΜ-500μΜ的范围内。可卡因的检测方法有以下几种:一种是使用一段适配体的方法(B.R.Baker，et.al，J.Am.Chem.Soc.2006，128，3138-3139)，在该方法中，适配体的一端修饰巯基，通过Au-S键固定在金电极表面，另一端修饰氧化还原基团亚甲基蓝(MB)。在可卡因存在的情况下，可卡因和其适配体相互作用，引起构象改变，导致MB接近电极表面，从而引起电极表面电流的增加，实现可卡因的定量检测，该方法的检测灵敏度为10 μ M。第二种是使用两段式适配体探针(J.Am.Chem.Soc.Vol.131，N0.21,2009，6944-6945.)，将一段探针通过巯基组装到电极上，而将另一段标记MB。在可卡因存在的情况下，MB修饰的探针通过可卡因与在电极表面上的探针形成超分子复合物而使MB靠近电极表面，从而引起电极表面电流的增力口，将检测的灵敏度提高了一个数量级(ΙμΜ)。专利申请CN102650612A提出了利用三段式适配体探针对可卡因进行电化学检测，其将适配体分为三段，灵敏度在0.ΙμΜ。专利CN101948907Β提出了利用未修饰的三段式适配体探针进行均相的可卡因纳米金颜色检测方法，该方法将基于一段或两段式适配体的可卡因纳米金颜色检测，灵敏度由2.5 μ M提高到0.5μΜ。该专利专利技术首次证实了将一段适配体探针分割成三段后，依然能够与可卡因自组装形成具有双链DNA结构。以上所述采用未修饰的三段式适配体探针进行可卡因颜色检测的方法，以及采用一段或两段适配体进行可卡因电化学检测的方法存在着以下不足:具有很大的局限性，检测灵敏度不高(0.5 μ M?10 μ M级)，标准偏差大，定量分析误差大。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种高灵敏度的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因进行电化学检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是:一种，包括以下步骤:I)将裸金电极抛光，洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10?15min，再取出清洗、干燥；2)将用TE缓冲液配制的巯基标记的适体片段Co3S滴加于上述金电极上，置于4°C冰箱过夜；3)将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭I?1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极2?3h ;4)将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加PB缓冲液配制的生物素标记的适体片段Co3B和待测样品溶液，然后在37°C下反应40?50min ；5)将步骤4中的金电极取出冲洗，加入PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液，37°C温育30?45min,取出冲洗；6)在步骤5中的金电极上加入PB缓冲液配制的环化DNA溶液，37°C温育30?45min,取出冲洗；7)在步骤6中的金电极上加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37°C滚环扩增I?1.5h，取出冲洗；8)在步骤7中的金电极上加入用2XSSC杂交液配制的生物素修饰的检测探针，37V杂交I?1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；9)在步骤8中的金电极上加入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25 μ g/mL的ST-AP, 37°C反应30?45min，用DEA缓冲液冲洗，在用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL a -NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，根据标准曲线，得到待检样品中可卡因的浓度。所述步骤I中金电极抛光用粒度为0.05 μ m的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H2SO4IH2O2体积比为3:1的溶液。所述的巯基标记的适体片段Co3S序列为:5’ -GGGAGTCAAGAACGAAAAAAAA-th i ο 1-(CH2)3，生物素标记的适体片段Co3B序列为:5’-TTCGTTCTTCAATGAAGTGGGACGACAAAAMA-biotin,检测探针序列为:5’ -Biotin-AAAAAAGCGCAGAATGGT,制作环化DNA时所用的引物DNA序列为:5’ -Biotin-AAAAAAAAAAAACAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAGA，待环化模板 DNA 序列为:5 ’-P-TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCAGAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATCTGCCCTGACTTC0所述步骤3至7中金电极的冲洗按照如下步骤完成:先用含0.005%吐温20Tris-HCl缓冲液冲洗三次，然后再用Tris-HCl缓冲液冲洗三次；Tris_HCl缓冲液为含有20mM Tris, 0.1M 氯化钠，5mM 氯化镁，pH 7.4。所述步骤3中的鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液按本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，包括以下步骤：1）将裸金电极抛光，洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10～15min，再取出清洗、干燥；2）将用TE缓冲液配制的巯基标记的适体片段Co3S滴加于上述金电极上，置于4℃冰箱过夜；3）将步骤2中的金电极取出，冲洗,用6?巯基?1?己醇封闭1～1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极2～3h；4）将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加PB缓冲液配制的生物素标记的适体片段Co3B和待测样品溶液，然后在37℃下反应40～50min；5）将步骤4中的金电极取出冲洗，加入PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液，37℃温育30～45min,取出冲洗；6）在步骤5中的金电极上加入PB缓冲液配制的环化DNA溶液，37℃温育30～45min，取出冲洗；7）在步骤6中的金电极上加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37℃滚环扩增1～1.5h，取出冲洗；8）在步骤7中的金电极上加入用2×SSC杂交液配制的生物素修饰的检测探针，37℃杂交1～1.5h，用DEA缓冲液清洗电极；9）在步骤8中的金电极上加入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25μg/mL的ST?AP，37℃反应30～45min，用DEA缓冲液冲洗，在用DEA缓冲液配制的0.75mg/mLα?NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，根 据标准曲线，得到待检样品中可卡因的浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，包括以下步骤: 1)将裸金电极抛光，洗涤，然后浸入食人鱼溶液中10~15min，再取出清洗、干燥； 2)将用TE缓冲液配制的巯基标记的适体片段Co3S滴加于上述金电极上，置于4°C冰箱过夜； 3)将步骤2中的金电极取出，冲洗，用6-巯基-1-己醇封闭I~1.5h，再次冲洗金电极，然后用鲑鱼精DNA和2%BSA混合溶液封闭金电极2~3h ; 4)将步骤3中封闭后的金电极取出冲洗，在金电极上滴加PB缓冲液配制的生物素标记的适体片段Co3B和待测样品溶液，然后在37°C下反应40~50min ； 5)将步骤4中的金电极取出冲洗，加入PB缓冲液配制的链酶亲和素溶液，37°C温育30~45min,取出冲洗； 6)在步骤5中的金电极上加入PB缓冲液配制的环化DNA溶液，37°C温育30~45min，取出冲洗； 7)在步骤6中的金电极上加入含dNTP、phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应液，37°C滚环扩增I~1.5h，取出冲洗； 8)在步骤7中的金电极上加入用2X SSC杂交液配制的生物素修饰的检测探针，37°C杂交I~1.5h，用DEA缓冲液清洗电极； 9)在步骤8中的金电极上加 入用含有0.8%BSA的DEA缓冲液配制的1.25 u g/mL的ST-AP, 37°C反应30~45min，用DEA缓冲液冲洗，在用DEA缓冲液配制的0.75mg/mL a -NP底物溶液中进行示差脉冲伏安法DPV信号检测，根据标准曲线，得到待检样品中可卡因的浓度。2.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述步骤I中金电极抛光用粒度为0.05 的氧化铝粉，所述的食人鱼溶液为浓H2SO4 = H2O2体积比为3:1的溶液。3.根据权利要求1所述的基于滚环扩增和超分子适体对可卡因电化学检测的方法，其特征在于:所述的巯基标记的适体片段Co3S序列为:5’-GGGAGTCAAGAACGAAAAAAAA-thiol-(CH2)3,生物素标记的适体片段 Co3B 序列为:5’-1TCGITCTTCAATGAAGTGGGACGACAAAAAAA-biotin，检测探针序列为:5’ -Biotin-AAAAAAGCGCAGAATGGT，制作环化DNA时所用的引物DNA序...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁世家，李剑波，汤华，唐仁宽，李永国，颜玉蓉，申波，朱丹，雷品华，张伟，刘刚，李佳迅，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：