一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统技术方案

本发明专利技术公开了一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统，是由含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞（A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc）、细胞培养裂解试剂，荧光素酶检测底物构成。利用本发明专利技术提供的抗肿瘤药物筛选系统，通过测定被筛选化合物作用于A549-pDR5-luc和H157-pDR5-luc细胞中荧光素酶报告基因表达的升高，来筛选促进DR5表达的化合物，实现抗肿瘤药物的筛选。本发明专利技术系统具有实验周期短，检测过程快，灵敏度高，应用范围广的特点，为高通量的抗肿瘤药物的筛选提供了新的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统
本专利技术涉及一种抗肿瘤药物筛选系统，尤其涉及一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统。
技术介绍
癌症目前已成为人类最主要的致死疾病之一，严重威胁着人们的寿命。我国城乡居民恶性肿瘤死亡率已属于世界较高水平，而且呈持续的增长趋势。中国每年癌症新发病例为220万，因癌症死亡人数为160万人。其中，肺癌和乳腺癌在过去的30年分别上升了465%和96%。恶性肿瘤已成为我国城市居民的第一位死亡原因，农村居民的第二位死亡原因。因此，我们对于肿瘤预防和治疗的研究已刻不容缓。化学疗法是目前治疗癌症的重要手段之一，寻找安全有效地化疗药物就显得尤其重要。近年来，分子靶向药物因其治疗作用的高特异性和可以大幅度减低患者发生副作用的风险而成为抗肿瘤研究的热点。随着我们对肿瘤细胞中TRAIL受体信号通路的研究不断深入，发现此通路中的死亡受体DR5是很有潜力的肿瘤治疗的新靶标。多种肿瘤预防及化疗药物均明显激活TRAIL受体信号通路，抑制此通路将显著降低药物诱导肿瘤细胞凋亡的效率。很多抗肿瘤药物上调TRAIL受体信号通路中DR5的表达，例如，本实验室发现蛋白酶体抑制剂硼替佐米(英文名PS-341)就是通过上调DR5的表达，而激活受体介导的凋亡信号通路。本实验室的工作还证明很多种进入临床实验的化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡也都需要激活死亡受体信号通路，TRAIL受体信号通路能否被激活也直接影响着肿瘤化疗的效果。随着生物技术的发展，以及对人类疾病的分子机制认识的加深，一种以特定药物靶点为基础的筛选方法，也就是基于靶点药物的研究方法已经取代了传统的非特异性的方法。其中，利用工程改造的细胞进行靶向药物筛选是最具有吸引力的一种方法。这种体外检测方法需要弄清楚特定的靶分子所引发的特定细胞行为工程，而且还需要建立一种易于检测产物量的方法，比如用灵敏度较高的荧光素酶(Luciferase)或绿色荧光蛋白GFP作为报告基因等。基于细胞的筛选方法与体外筛选方法相比有很多显著的优点。第一，不需要纯化靶蛋白，这就大大节省了成本和时间。第二，在细胞中，靶蛋白的构象、活性以及生物学功能更能接近于生理学状态。因此，经过筛选得到的先导化合物具有更高的可靠性。经检索，目前并没有基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统。为了达到上述目的，本专利技术是通过以下技术方案来实现:本专利技术所述的一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统是由含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞、细胞培养裂解试剂，荧光素酶检测底物构成。上述含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞优选含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的非小细胞肺癌细胞A549，命名为:A549-pDR5-luc ;或是含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的非小细胞肺癌细胞H157，命名为:H157-pDR5-luc ;所述细胞培养裂解试剂为promega公司的荧光素酶检测系统中的细胞培养裂解试剂，主要是对细胞进行裂解；荧光素酶检测底物为promega公司的荧光素酶检测系统中的荧光素酶检测底物，其在荧光素酶作用下被氧化，并发出生物荧光。上述的基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统在筛选抗肿瘤药物中的应用。本专利技术提供的抗肿瘤药物筛选系统利用TRAIL受体信号通路作为新的抗肿瘤药物筛选的靶标，根据TRAIL受体信号通路中标志蛋白DR5的表达情况来预测药物杀伤肿瘤细胞的效果，以期建立快速高效的抗肿瘤药物筛选系统。在应用过程中，是通过测定被筛选化合物作用于A549-pDR5-luc或H157-pDR5-luc细胞中荧光素酶报告基因表达的升高，来筛选促进TRAIL受体DR5表达的化合物，即抗肿瘤药物，因此本专利技术可以高效的对化合物进行筛选，确定它们是否有抗肿瘤作用。本专利技术所述的基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统在筛选抗肿瘤药物中的应用具体步骤是:I)选择所构建的A549-pDR5-luc或H157-pDR5_luc细胞以6X IO4个/孔细胞接种于含5%血清的RPM1640培养基的24孔板中，在37°C，5%C02，饱和湿度的培养箱中培养24—48h ；2)选取待筛选的化合物，根据其特性先溶解为ImM — IOmM浓度的溶液，然后将溶解好的化合物按终浓度是O — 40 μ M的梯度浓度加入到步骤I)培养的细胞中，同时每种浓度设置3个平行孔，然后处理6 — 12h ；3)待处理结束时，弃掉各孔中的细胞培养基，再用PBS清洗一次细胞，然后每孔中加入200— 250 μ L细胞裂解液，使裂解缓冲液完全覆盖细胞，并在4°C静置，裂解处理30—40min ；4)充分吹打裂解后的细胞，将所有的细胞碎片和液体转移至离心管中，在4°C的离心机中，13000±500rpm 下离心 2—5min ；5)取15 μ L离心后样品的上清液与10 μ L荧光素酶检测底物共放入荧光光度计试管中混匀并使其反应；6)将反应后的试管放入荧光光度计中进行检测，记录数据并求取平均值，根据检测的数值判断该待筛选的化合物是否有抗肿瘤活性；当待筛选的化合物药物处理组的检测数值减去对照组的检测数值大于5000时，说明该待筛选的化合物能明显诱导DR5启动子的活化，预示该化合物为潜在的抗肿瘤化合物。所述对照组的检测数值对于A549-pDR5-luc细胞，空白对照组数值一般为4000±500 ;对`于H157-pDR5-luc细胞，空白对照组数值一般为 8000 ±500。其中:上述待筛选的化合物是合成化合物、天然产物、有机小分子、无机小分子、月旨类、糖类中的一种或几种。上述待筛选的化合物进一步优选从天然植物中提取的化合物2’-羟基，4’，5’- 二甲氧基查尔酮(DHMC)或豆蘧明(Cardamonin)。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果:1.本专利技术系统是一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统，目前已证明多种肿瘤预防及化疗药物均明显激活TRAIL受体信号通路，激活此通路将显著上调药物诱导肿瘤细胞凋亡的效率，因此以TRAIL受体作为靶标，基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统，具有很高的可靠性和适应性。2.本专利技术系统不需要纯化靶蛋白，这就大大节省了成本和时间，具有极高的新颖性和实用性。另外在细胞中的靶蛋白的构象、活性以及生物学功能更能接近于生理学状态，因此，经过筛选得到的先导化合物也具有很高的可靠性。3.本专利技术系统是利用荧光素酶作为报告基因，用荧光光度计Luminometer检测荧光素酶报告基因的活性，反映细胞中DR5的活化情况，进而反映该药物的抗肿瘤作用，因此更直接，灵敏度较高。4.本专利技术系统可应用于筛选各种化合物，包括合成化合物、天然产物、有机小分子、无机小分子、脂、糖类等等，也可以用于检测多种药物联合的作用，应用范围广，具有极大的灵活性。5.本专利技术系统实验周期短，检测过程快速。6.本专利技术系统同时也适合于高通量的抗肿瘤药物的筛选，可以将细胞接种在96孔板，然后用带有自动注射器的 多孔板发光仪器来检测荧光素酶报告基因的活性，高效快速本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统，其特征在于：所述系统由含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞、细胞培养裂解试剂，荧光素酶检测底物构成。

【技术特征摘要】
1.一种基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统，其特征在于:所述系统由含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞、细胞培养裂解试剂，荧光素酶检测底物构成。2.根据权利要求1所述的基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统，其特征在于:所述含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的细胞是含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的非小细胞肺癌细胞A549，命名为:A549-pDR5-luc ;或是含DR5启动子与荧光素酶报告基因的融合基因的非小细胞肺癌细胞H157，命名为:H157-pDR5-luc ;所述细胞培养裂解试剂为promega公司的荧光素酶检测系统中的细胞培养裂解试剂；所述荧光素酶检测底物为promega公司的荧光素酶检测系统中的荧光素酶检测底物。3.权利要求2所述的基于TRAIL受体信号通路的抗肿瘤药物筛选系统在筛选抗肿瘤药物中的应用，步骤是: 1)选择所构建的A549-pDR5-luc或H157-pDR5_luc细胞以6XIO4个/孔细胞接种于含5%血清的RPM1640培养基的24孔板中，在37°C，5%C02，饱和湿度的培养箱中培养24—48h ； 2)选取待筛选的化合物，根据其特性先溶解为ImM— IOmM浓度的溶液，然后将溶解好的化合物按终浓度是O — 40 μ M的梯度浓度加入到步骤I)培养的细胞中，同时每种浓度设置3个平行孔,然后处理6— 12h ； 3...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏玲，刘相国，徐林艳，杨丽娜，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：