本发明专利技术公开了一种利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，以蔗渣为原料，通过原料预处理、纤维素酶解，以霉菌为发酵菌种，以蔗渣纤维素的酶解液为碳源，游离细胞发酵或固定化细胞发酵生产L-乳酸。该法原料易得、成本低廉；酶解得到的还原糖量与其他报道相比较高，发酵周期短，发酵液分离容易，产品转化率高；既可采用游离发酵，也可进行固定化发酵，后者固定细胞可重复利用，产酸率稳定，乳酸转化率高。总之，本发明专利技术是一种适应于工业化的高效转化蔗渣纤维素生产L-乳酸的方法，大大降低了乳酸的生产成本，解决了乳酸菌发酵过程难控制以及游离细胞对分离提纯造成的难度问题，具有良好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法
本专利技术属于微生物发酵生产有机酸的
，尤其涉及一种利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法。
技术介绍
L-乳酸(L-lactic acid)是在微生物发酵过程中通过L-乳酸脱氢酶的催化作用将丙酮酸转换成的左旋乳酸。与D-乳酸相比，由于L -乳酸可被人体直接吸收，且无任何副作用，所以被广泛应用于食品、医药、化工等领域。目前发酵产L-乳酸的微生物主要是乳酸菌和根霉菌，乳酸菌对营养成分要求高，而且是兼性厌氧型微生物，发酵过程中不好控制，生产的L-乳酸光学纯度也不高。传统发酵多采用游离细胞发酵方式，游离发酵中，真菌菌丝比较发达，经常出现凝块和结团现象，悬浮的菌丝体还会增加发酵液的粘度，减少了细胞间的氧气传递，降低了乳酸的产量，而且对后续的分离过程也有影响，分离难度大，得到的产物少。生产成本是制约L-乳酸应用的关键因素之一。工业化生产都采用淀粉质原料，这大大增加了生产成本。而一些廉价可再生的原料，如生物质原料，含有丰富的碳水化合物，可用于L-乳酸的生产。我国是农业大国，每年产生上亿吨的农林废弃物，但是只有极少数被有效地利用，大部分被作为废弃物丢掉。这不仅浪费了丰富的可再生资源，而且也污染了环境。因此，若能利用这些生物质纤维素来生产L-乳酸等各类高附加值产品，走“变废为宝”的路线，应用前景 将非常广阔。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种生产成本低、发酵周期短、工艺简单可控、产品纯度高的利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案:利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，以蔗渣为原料，通过原料预处理、纤维素酶解，以霉菌为发酵菌种，以蔗渣纤维素的酶解液为碳源，游离细胞发酵或固定化细胞发酵生产L-乳酸。原料预处理按以下操作进行:用粉碎机粉碎蔗渣，过20-40目筛；精确称取过筛后的蔗渣30g，按料液比为1:30加入质量浓度为0.6-0.8%的H2O2和3_5%的NaOH混合溶液，于85°C下搅拌3-5h ;抽滤，用蒸馏水洗涤至滤液为中性，残渣于105°C干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎机粉碎，过20-40目筛，收集备用。纤维素酶解按以下操作进行:精确称取预处理后的蔗渣，按每g蔗渣加入浓度为10mg/mL的纤维素酶液4_8mL，底物浓度28_66g/L，pH4.0-5.4的柠檬酸缓冲溶液17_21mL，于45-55°C、转速120r/min的恒温水浴锅中酶解36_60h，然后煮沸灭酶活，离心分离，回收酶解液备用，测定酶解液中的还原糖含量。上述利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，采用游离细胞发酵方式，按以下操作进行:〈1>斜面培养:将菌种米根霉(Gim3.129)接入灭菌的试管PDA培养基中，于28°C培养4-6天，后于4°C冰箱中保存；〈2>孢子悬浮液:取一支已培养好的斜面菌种，用无菌生理盐水将斜面上的孢子洗下，于灭菌的三角瓶中，加入无菌的玻璃珠充分打散，用灭菌的脱脂棉过滤，用无菌水冲洗滤渣，使滤液体积为30mL，稀释至孢子悬浮液含I X IO7个孢子/mL ；<3>种子培养:将孢子悬浮液按4%的接种量接入到装液量为20_70mL的三角瓶中，于28-32°C、200r/min下培养12_24h，制成种子培养液；<4>发酵培养:将种子培养液按10-14%的接种量接入到装液量为50mL的三角瓶中，30°C、180-200r/min下，发酵36_72h，得到含发酵产物L-乳酸的发酵液；发酵结束后，对发酵液进行抽滤，取清液，按EDTA法测定L-乳酸的浓度，计算L-乳酸的转化率(L-乳酸的转化率=(L-乳酸的浓度/还原糖的浓度)X 100%)。斜面培养基按以下配制:马铃薯200g，加水1000mL,葡萄糖15_25g，琼脂15_25g，加热溶解分装试管，121°C灭菌20min ；种子培养基按以下配制:葡萄糖为50_70g/L，酵母膏(氮源)5_7g/L，KH2PO40.3-0.5g/L, MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.08g/L, CaC0310g/L, 121。。灭菌20min, CaCO3分开灭菌。发酵培养基按以下配制:酶解液30-38g/L，(NH4) 2S043_7g/L，KH2PO40.2-0.4g/L，MgSO4.7Η200.2-0.4g/L, ZnSO4.7Η200.04-0.08g/L, CaC0310_30g/L，121。。灭菌 20min, CaCO3分开灭菌。上述利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，采用固定化细胞发酵方式，按以下操作进行:〈1>斜面培养:将菌种米根`霉(Gim3.129)接入灭菌的试管PDA培养基中，于28°C培养4-6天，后于4°C冰箱中保存；<2>孢子悬浮液:取一支已培养好的斜面菌种，用无菌生理盐水将斜面上的孢子洗下，于灭菌的三角瓶中，加入无菌的玻璃珠充分打散，用灭菌的脱脂棉过滤，用无菌水冲洗滤渣，使滤液体积为30mL，稀释至孢子悬浮液含I X IO7个孢子/mL ；<3>ACA微胶囊法固定化细胞制备:将灭菌的质量浓度为1.5-2.5%的海藻酸钠和制备好的孢子悬浮液(按5:1)—起混合于灭过菌的三角瓶中充分摇匀；用同一型号的注射器(内径Imm)将混合液逐滴加入到质量浓度2.0-3.0%的CaCl2溶液中，钙化0.5-1.5h，形成直径为3-4mm的海藻酸钙微球，去掉上清液,用无菌水洗去CaCl2,再于质量浓度0.4-0.8%的壳聚糖溶液(溶于1%的冰醋酸溶液)中成膜15min，弃去多余的壳聚糖，洗净，用0.15%的海藻酸钠溶液处理微胶囊表面5min，再用0.075mol/L的柠檬酸钠溶液囊内液化15_25min，滤去处理液，用无菌水洗净，用无菌生理盐水于4°C下保存(不超过3天)，备用。<4>固定化细胞培养:将固定化细胞接入到装液量为50mL的三角瓶中，于30°C、200r/min下培养12_24h，制成固定化细胞培养液；<5>发酵培养:将固定化细胞培养液按10-14%的接种量接入到装液量为50mL的三角瓶中，30°C、180-200r/min下，发酵36_50h，得到含发酵产物L-乳酸的发酵液；发酵结束后，对发酵液进行抽滤，取清液，按EDTA法测定L-乳酸的浓度，计算L-乳酸的转化率(L-乳酸的转化率=(L-乳酸的浓度/还原糖的浓度)X 100%。固定化发酵时间为36h。固定化细胞的重复利用批次为7批。针对目前L-乳酸生产存在的问题，专利技术人以蔗渣为原料，首次建立了利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，通过原料预处理、纤维素酶解，以霉菌为发酵菌种，以蔗渣纤维素的酶解液为碳源，游离细胞发酵或固定化细胞发酵生产L-乳酸。该法原料易得、成本低廉；酶解得到的还原糖量与其他报道相比较高，发酵周期短，发酵液分离容易，产品转化率高；既可采用游离发酵，也可进行固定化发酵，后者固定细胞可重复利用，产酸率稳定。总之，本专利技术是一种适应于工业化的高效转化蔗渣纤维素生产L-乳酸的方法，大大降低了乳酸的生产成本，解决了乳酸菌发酵过程难控制以及游离细胞对分离提纯造成的难度问题，具有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用蔗渣纤维素发酵生产L?乳酸的方法，其特征在于以蔗渣为原料，通过原料预处理、纤维素酶解，以霉菌为发酵菌种，以蔗渣纤维素的酶解液为碳源，游离细胞发酵或固定化细胞发酵生产L?乳酸。
【技术特征摘要】
1.一种利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于以蔗渣为原料，通过原料预处理、纤维素酶解，以霉菌为发酵菌种，以蔗渣纤维素的酶解液为碳源，游离细胞发酵或固定化细胞发酵生产L-乳酸。2.根据权利要求1所述的利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于原料预处理按以下操作进行:用粉碎机粉碎蔗渣，过20-40目筛；精确称取过筛后的蔗渣30g，按料液比为1:30加入质量浓度为0.6-0.8%的H2O2和3-5%的NaOH混合溶液，于85°C下搅拌3-5h;抽滤，用蒸馏水洗涤至滤液为中性，残渣于105°C干燥箱中干燥至恒重，再用粉碎机粉碎，过20-40目筛，收集备用。3.根据权利要求2所述的利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于纤维素酶解按以下操作进行:精确称取预处理后的蔗渣，按每g蔗渣加入浓度为lOmg/mL的纤维素酶液4-8mL，底物浓度28-66g/L，pH4.0-5.4的柠檬酸缓冲溶液17_21mL，于45_55°C、转速120r/min的恒温水浴锅中酶解36_60h，然后煮沸灭酶活，离心分离，回收酶解液备用。4.根据权利要求3所述的利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于采用游离细胞发酵方式，按以下操作进行: 〈1>斜面培养:将菌种米根霉(Gim3.129)接入灭菌的试管PDA培养基中，于28°C培养4-6天，后于4°C冰箱中保存； <2>孢子悬浮液:取一支已培养好的斜面菌种，用无菌生理盐水将斜面上的孢子洗下，于灭菌的三角瓶中，加入无菌的玻璃珠充分打散,用灭菌的脱脂棉过滤,用无菌水冲洗滤渣，使滤液体积为30mL，稀释至孢子悬浮液含I X IO7个孢子/mL ； <3>种子培养:将孢子悬浮液按4%的接种量接入到装液量为20-70mL的三角瓶中，于28-320C >200r/min下培养12_24h，制成种子培养液； <4>发酵培养:将种子培养液按10-14%的接种量接入到装液量为50mL的三角瓶中，300C、180-200r/min下，发酵36_72h，得到含发酵产物L-乳酸的发酵液。5.根据权利要求4所述的利用蔗渣纤维素发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于: 所述斜面培养基按以下配制:马铃薯200g，加水lOOOmL，葡萄糖15_25g，琼脂15_25g，加热溶解分装试管，121°C灭菌20min ； 所述种子培养基按以下配制:葡萄糖为50-70g/L，酵母膏5-7g/L，KH2PO40.3-0.5g/...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙卫东，唐艳琼，戴莉，唐湘毅，苏芬芬，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
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