本发明专利技术涉及一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，其特征在于选用地衣芽孢杆菌(Baclicus?lincheniformis)ELAT4（CGMCC5700）作为弹性蛋白酶生产的菌种，经地衣芽孢杆菌菌种活化、种子液制备、发酵液培养、深层液体通风发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂。本发明专利技术制得的液体酶活力达到352U/ml、固体酶制剂酶活力达到2512u/g。本发明专利技术具有提高产弹性蛋白酶的效率、增强弹性蛋白酶的活性和降低生产成本的优点，且生产过程无废固物处理问题，对环境无污染。本发明专利技术适用于大批量生产弹性蛋白酶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，特别是涉及。
技术介绍
弹性蛋白酶是一种以分解不溶性弹性蛋白为特征的蛋白水解酶，主要存在于动物胰脏中，在皮肤、主动脉、血小板和白血球中也有分布，同时，在微生物类群中也广有分布，细菌、放线菌、真菌中都能分泌胞外弹性蛋白酶。弹性蛋白酶可使结缔组织蛋白质中的弹性蛋白消化分解，包括肽键结合的、酰胺结合的和酯结合的进行加水分解。弹性蛋白酶具有明显的β -脂蛋白酶作用，能活化磷酯酶Α，降低血清胆固醇，改善血清脂质，降低血浆胆固醇及第密度脂蛋白、甘油三酯，升高密度脂蛋白、阻止脂质向动脉壁沉积和增大动脉的弹性，具有抗动脉粥样硬化及抗脂肪肝作用。在医学临床主要用于治疗高血脂症，防止动脉粥样硬化、脂肪肝。由于弹性蛋白酶能够专一降解结缔组织中坚韧的弹性纤维组分，所以当其他蛋白与弹性蛋白共存时，此酶优先对弹性蛋白水解，因此弹性蛋白酶也可以作为理想的肉类嫩化剂用于食品加工业。所以根据弹性蛋白酶的特性，弹性蛋白酶不仅在医药上有其应用价值，而且在食品、日用化工工业上有着广阔的前景和商业价值。目前，弹性蛋白酶大都是通过从动物的胰脏中获取得方法来制备的，这种方法产酶量低，保藏性不好，过程较为复杂，而且成本高。如何克服现有技术的不足已成为当今生物工程
亟待解决的重点难题之一。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足而提供，本专利技术具有提高产弹性蛋白酶的效率、增强弹性蛋白酶的活性和降低生产成本的优点，适用于大批量生产弹性蛋白酶。根据本专利技术提出的，其特征在于选用地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)ELAT4(CGMCC5700)作为弹性蛋白酶生产的菌种，经地衣芽孢杆菌菌种活化、种子液制备、发酵液培养、深层液体通风发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂，具体步骤如下: 步骤一，菌种活化:将保藏的地衣芽孢杆菌在菌种活化培养基上划线两次，均在37°C培养箱中培养18_24h，第二次划线以第一次划线得到的单菌落为菌种。然后从第二次划线的平板上挑选单菌落接入液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基，培养温度37°C、时间 180-200r / min、摇瓶培养 OD600 至 ID600 ； 步骤二，种子液制备:从活化好的液体试管中接种菌液到种子培养基，培养温度35-37°C、时间160-180r / min、摇床震荡培养18_24h，成为种子液；过平板划线法，用接种环从保存的菌种斜面中接种到菌种活化固体培养基中，放置37 °C培养箱中培养18-24h，然后再次从活化的固体培养基中挑取单菌落接种到另一个菌种活化固体培养基上，进行二次活化，培养条件:37°C培养箱中培养18-24h ;从平板上挑选单菌落接入含5mL液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基的试管中，将试管置于摇床，培养温度37°C、时间180-200r / min、摇瓶培养 OD600 至 ID600 ； 步骤三，摇瓶发酵液培养:将培养好的种子培养液以2%-8% (v / v)的接种量，接种至250ml三角瓶中，160-180r / min摇床震荡培养；摇瓶发酵培养基发酵前6_10h控制温度为35-37°C，IOh后切换至26-30°C并保持到发酵结束；发酵O-1Oh过程中控制发酵液PH7.0-7.5，IOh后至发酵结束过程中将pH保持在7.5-8.5 ； 步骤四，深层液体通风发酵:发酵罐灭菌前，按照1: 1000的比例加入消泡剂，发酵过程中的罐压维持0.04Mpa ;接种量3-6% (v / v)、发酵罐初始发酵培养基自发酵初始至发酵14h,通风量0.55vvm ;发酵14_24h,通风量0.75vvm ;发酵25h至发酵结束，通风0.6vvm ；发酵0-30h，温度34-36°C ;发酵30h后温度25_30°C ;发酵过程pH7.5-8.0 ;发酵达到25h补加浓度为100g / L的葡萄糖溶液80ml ;发酵达到30h，再次补加浓度100g / L的葡萄糖100ml ;发酵达到35h，补加浓度为100g / L的豆饼粉乳浊液150ml ； 步骤五，弹性蛋白酶酶制剂成品制备: (1)、发酵液除菌:发酵液4°C、8000r/min离心IOmin去除菌体； (2)、超滤浓缩:第一次采用截留分子质量为60kDa的超滤膜过滤，保留滤出液；第二次用20kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3-5倍，保存截留液； (3)、硫酸铵盐析:将超滤后的滤液调节pH至6.5，向滤液中加入硫酸铵至饱和度25%，4°C静置8-10h，然后在4°C下8000r/min离心机离心lOmin，去除底部沉淀，收集上清液；调节上清液PH8.5，添加硫酸 铵至饱和度70%，4°C静置8-10h后冷冻并离心收集沉淀蛋白；0.02mol / L、ρΗ7.5的Tris-HCl缓冲溶液溶解沉淀，并充分透析； (4)、真空冷冻干燥:将透析后的酶液20kDa的超滤膜超滤，浓缩6-10倍，加入保护剂1-2%海藻酸钠、2-3%蔗糖、3-5%麦芽糊精、0.1-0.25%山梨酸钾和0.1-0.4%苯甲酸钠；经充分分散后，_20°C冷冻8-10h、真空度30-50Pa，温度_35°C以下、冷冻15_18h，再经粉碎即制得弹性蛋白酶酶制剂成品。经测定，本专利技术方法制得的弹性蛋白酶酶制剂成品的指标为:成品为棕褐色固体粉末、可溶于水、无异味；酶活力2512u / g，成品热稳定性为25°C条件下保存6个月后酶活力仍大于90% ;酶催化活性适合作用的温度范围35°C -40°C ;成品适合作用的pH值范围7.0-8.5;本专利技术采用摇瓶发酵方式所得的酶活力为:212u / ml ;通过发酵方法，发酵液酶活达到:352U / ml。本专利技术与现有技术相比其显著优点在于:一是本专利技术发酵制备弹性蛋白酶的酶活性高，液体酶活力达到352U / ml、固体酶制剂酶活力达到2512u / g，弹性蛋白酶的总酶活回收率达80%以上、收率高，适合大批量生产制造；二是本专利技术以豆饼粉、麸皮、蛋白胨、玉米粉为主要原料，生产成本低，酶制剂制备过程采用离心、超滤、硫酸铵盐析、透析、冷冻干燥等步骤，产品杂质含量低，达到食品添加剂标准的要求；三是操作工艺简单，生产效率高、成本低，适合工业化生产；四是生产过程无废固物处理问题，对环境无污染。本专利技术适用于大批量生产弹性蛋白酶。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术的【具体实施方式】作进一步的详细说明。本专利技术实施例所用的菌种为地衣芽孢杆菌，该菌种保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏序列号为CGMCC N0.5700。本专利技术提出的，选用地衣芽孢杆菌(Baclicus lincheniformis)ELAT4(CGMCC5700)作为弹性蛋白酶生产的菌种，经地衣芽孢杆菌菌种活化、种子液制备、发酵液培养、深层液体通风发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂，具体步骤如下: 步骤一，菌种活化:将保藏的地衣芽孢杆菌在菌种活化培养基上划线两次，均在37°C培养箱中培养18_24h，第二次划线以第一次划线得到的单菌落为菌种。然后从第二次划线的平板上挑选单菌落接入液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，其特征在于选用地衣芽孢杆菌(Baclicus?lincheniformis)?ELAT4?（CGMCC?5700）作为弹性蛋白酶生产的菌种，经地衣芽孢杆菌菌种活化、种子液制备、发酵液培养、深层液体通风发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂，具体步骤如下：步骤一，菌种活化：将保藏的地衣芽孢杆菌在菌种活化培养基上划线两次，均在37℃培养箱中培养18?24h，第二次划线以第一次划线得到的单菌落为菌种，然后从第二次划线的平板上挑选单菌落接入液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基，培养温度37℃、时间180?200r/min、摇瓶培养OD600至lD600；步骤二，种子液制备：从活化好的液体试管中接种菌液到种子培养基，培养温度35?37℃、摇床震荡频率160?180r/min、摇床震荡培养18?24h，成为种子液；平板划线法，用接种环从保存的菌种斜面中接种到菌种活化固体培养基中，放置37℃培养箱中培养18?24h，然后再次从活化的固体培养基中挑取单菌落接种到另一个菌种活化固体培养基上，进行二次活化，在37℃培养箱中培养18?24h；从平板上挑选单菌落接入含5mL液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基的试管中，将试管置于摇床，培养温度37℃、时间180?200r/min、摇瓶培养OD600至lD600；步骤三，摇瓶发酵液培养：将培养好的种子培养液以2％?8%(v/v)的接种量，接种至250ml三角瓶中，160?180r/min摇床震荡培养；摇瓶发酵培养基发酵前6?10h控制温度为35?37℃，10h后切换至26?30℃并保持到发酵结束；发酵0?10h过程中控制发酵液pH7.0?7.5，10h后至发酵结束过程中将pH保持在7.5?8.5；其中，pH保持为采用滴加酸碱溶液的方法；步骤四，深层液体通风发酵：发酵罐灭菌前，按照l:1000的比例加入消泡剂，发酵过程中的罐压维持0.04Mpa；接种量3?6％(v/v)、发酵罐初始发酵培养基自发酵初始至发酵14h，通风量0.55vvm；发酵14?24h，通风量0.75vvm；发酵25h至发酵结束，通风0.6vvm；发酵0?30h，温度34?36℃；发酵30h后温度25?30℃；发酵过程pH7.5?8.0；发酵达到25h补加浓度为100g/L的葡萄糖溶液80ml；发酵达到30h，再次补加浓度100g/L的葡萄糖100ml；发酵达到35h，补加浓度为100g/L的豆饼粉乳浊液150ml；步骤五，弹性蛋白酶酶制剂成品制备：（1）、发酵液除菌：发酵液4℃?、8000r/min离心10min去除菌体；（2）、超滤浓缩：第一次采用截留分子质量为60kDa的超滤膜过滤，保留滤出液；第二次用20kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3?5倍，保存截留液；（3）、硫酸铵盐析：将超滤后的滤液调节pH至6.5，向滤液中加入硫酸铵至饱和度25%，4℃静置8?10h，然后在4℃下8000r/min离心机离心10min，去除底部沉淀，收集上清液；调节上清液pH8.5，添加硫酸铵至饱和度70%，4℃静置8?10h后冷冻并离心收集沉淀蛋白；0.02mol/L、pH7.5的Tris?HCl缓冲溶液溶解沉淀，并充分透析；（4）、真空冷冻干燥：将透析后的酶液20kDa的超滤膜超滤，浓缩6?10倍，加入保护剂1?2%海藻酸钠、2?3%蔗糖、3?5%麦芽糊精、0.1?0.25%山梨酸钾和0.1?0.4%苯甲酸钠；经充分分散后，?20℃冷冻8?10h、真空度30?50Pa，温度?35°C以下、冷冻15?18h，再经粉碎即制得弹性蛋白酶酶制剂成品。...
【技术特征摘要】
1.一种利用微生物液态发酵生产弹性蛋白酶酶制剂的方法，其特征在于选用地衣芽孢杆菌{Baclicus lincheniformis) ELAT4 (CGMCC 5700)作为弹性蛋白酶生产的菌种,经地衣芽孢杆菌菌种活化、种子液制备、发酵液培养、深层液体通风发酵和弹性蛋白酶酶制剂成品制备步骤，而制得弹性蛋白酶酶制剂，具体步骤如下: 步骤一，菌种活化:将保藏的地衣芽孢杆菌在菌种活化培养基上划线两次，均在37°C培养箱中培养18_24h，第二次划线以第一次划线得到的单菌落为菌种，然后从第二次划线的平板上挑选单菌落接入液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基，培养温度37°C、时间 180-200r/min、摇瓶培养 OD_ 至 ID6tltl ； 步骤二，种子液制备:从活化好的液体试管中接种菌液到种子培养基，培养温度35-37°C、摇床震荡频率160-180r/min、摇床震荡培养18_24h，成为种子液；平板划线法，用接种环从保存的菌种斜面中接种到菌种活化固体培养基中，放置37 V培养箱中培养18-24h，然后再次从活化的固体培养基中挑取单菌落接种到另一个菌种活化固体培养基上，进行二次活化，在37 °C培养箱中培养18-24h ;从平板上挑选单菌落接入含5mL液体菌种活化培养基或固体菌种活化培养基的试管中，将试管置于摇床，培养温度37°C、时间180-200r/min、摇瓶培养 OD_ 至 ID6tltl ； 步骤三，摇瓶发酵液培养:将培养好的种子培养液以2% -8%(v/v)的接种量，接种至250ml三角瓶中，160-180r/min摇床震荡培养；摇瓶发酵培养基发酵前6_10h控制温度为35-37°C，IOh后切换至26-30°C并保持到发酵结束；发酵O-1Oh过程中控制发酵液PH7.0-7.5，IOh后至发酵结束过程中将pH保持在7.5-8.5 ;其中，pH保持为采用滴加酸碱溶液的方法； 步骤四，深层液体通风发酵:发酵罐灭菌前，按照1:1000的比例加入消泡剂，发酵过程中的罐压维持0.04Mpa ;接种量3-6% (v/v)、发酵罐初始发酵培养基自发酵初始至发酵14h,通风量0.55vvm ;发酵14_24h,通风量0.75vvm ;发酵25h至发酵结束,通风0.6vvm ;发酵0-30h，温度34-36°C;发酵30h后温`度25_30°C;发酵过程pH7.5-8.0 ;发酵达到25h补加浓度为100g/L的葡萄糖溶液80ml ;发酵达到30h，再次补加浓度100g/L的葡萄糖100ml ；发酵达到35h，补加浓度为100g/L的豆饼粉乳浊液150ml ； 步骤五，弹性蛋白酶酶制剂成品制备: (1)、发酵液除菌:发酵液40C、8000r/min离心IOmin去除菌体； (2)、超滤浓缩:第一次采用截留分子质量为60kDa的超滤膜过滤，保留滤出液；第二次用20kDa的超滤膜过滤，滤液浓缩3-5倍，保存截留液； (3)、硫酸铵盐析:将超滤后的滤液调节pH至6.5，向滤液中加入硫酸铵至饱和...
【专利技术属性】
技术研发人员：高兆建，张桂英，张建萍，侯进慧，陈尚龙，张从省，
申请(专利权)人：徐州工程学院，
类型：发明
国别省市：
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