一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，首先活化乳酸片球菌PA003菌种于液体MRS培养基中，利用生长培养基进行培养，使其活性及存活性最佳；然后利用冷冻离心机离心法收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮于已灭菌的冷冻干燥保护剂培养基中，通过逐步冷冻法将溶液冷冻，待其结冰后准备进行冷冻干燥；最后将结冰样品放置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥；最后获得的冷冻干燥制剂密封避光放置于室温下贮藏。用本发明专利技术制备的乳酸片球菌存活率高达81.96%，复性后具有乳酸菌属的发酵特性的同时仍保持对单核增多症李斯特氏菌的抑菌活性，适于开发后大规模工业化生产，在食品业和饲料业中作为生物防腐剂或是饲料添加剂使用具有很大的潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种冷冻干燥制剂的制备方法，特别涉及及使用方法。
技术介绍
自人类使用乳酸菌生产发酵食品以来至少已有4000多年的历史，主要用于生产发酵乳制品、发酵蔬菜和发酵肉制品等。乳酸菌发酵食品风味独特，对人类和动物有益生作用，甚至有些菌种具有防腐作用，这些乳酸菌在世界范围内深受喜爱。目前，乳酸片球菌能赋予食品柔和的酸味及香气，改进食品的品质和营养，还具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异和增强免疫力等重要生物学功能。其作为发酵菌种已经大量的在多国的食品中使用，是备受人们喜爱和接受的有益菌群。此外，其显著的抑菌效果，使得乳酸片球菌潜藏着巨大的应用价值和广阔的应用前景。国内外目前对于乳酸片球菌抑菌作用的研究大多都致力于片球菌素的研究上，主要是通过各种方法获得高效高产量的片球菌素，如:优化培养及各种条件，基因工程技术等方法来获得高效高产量的细菌素。但作为人体有益菌的乳酸菌属乳酸片球菌，其活菌的使用及活菌抑菌试验的研究报道却在国内外鲜见。本专利技术所用乳酸片球菌菌株(pediococcusacidilatici) PA003是天津大学化工学院周志江教授研究室的特有菌种，最初从一种发酵白菜(东北酸白菜)中分离纯化得到的(已在专利CN102115720B中公开，可从天津大学化工学院食品科学系食品生物技术研究室获取)。此乳酸片球菌PA003能发酵糖类生成片球菌素——是一种多肽的天然生物防腐剂，属于热稳定多肽细菌素，可以抑制很广范围内的革兰氏阳性菌，具有广谱抗菌性。而该片球菌是乳酸细菌的一个种，既能发酵一些食品，又具备防腐功能，人们还可以直接食用，其作为天然物质进行使用时比目前备受争议的转基因物质和人工合成物质或化合物更能得到大众的认可和接受。目前国内外尚未见乳酸片球菌冷冻干燥制剂研究的报道，因此，为了保证制作出的冷冻干燥制剂能稳定的长期贮藏，且复性后具有较高的存活率和较稳定的抑菌活性，以及在操作，贮藏，销售，使用中更加方便可行，就必须针对制备乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的各种影响因素进行认真研究。而从技术和商业相结合的角度出发，菌种的生长及其进行冷冻干燥、复性、冷冻干燥后长期贮藏过程中受到的影响都是该冷冻干燥制剂在复性后具有高活性和高生存能力的重要研究核心。而上述研究过程中的主要的影响因素又分为:固有的内在因素，包括:细胞的大小、遗传基因、细胞壁和细胞膜的组成；生长因素，包括:可兼容溶质积累物、胞外多糖的产生、细胞膜的变化；半致死处理；干燥培养基，包括:脱脂牛奶粉、渗透性化合物、半渗透性化合`物、不渗透的化合物；贮藏和复性，贮藏包括:氧气、水分、温度，复性包括:复性液的PH值、温度、容量、营养物质成分和含量、能量物质成分和含量。因此，针对不同影响因素对于菌属中不同的种有不同的影响结果，不同种之间的最适条件也不相同等可能出现的问题，再加上乳酸片球菌PA003菌株在制作为冷冻干燥制剂后，后期使用和长期储存过程中必须具备抑菌活性，那么必须对冷冻干燥法制备冷冻干燥制剂及复性过程中影响乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率和抑菌活性的三大影响因素(即:生长培养基，冷冻干燥保护剂，复性条件)进行逐一研究。研制出制备乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的最佳方法。最终能让乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂有效地，合理地，方便地作为天然生物防腐剂、发酵剂、饲料添加剂运用到各种食品和相关产业中。从而显现出乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂天然，无害，无污染，安全的发酵功能和生物防腐功效。以上的所有研究专利技术都是具很高的研究价值和意义的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，填补国内外乳酸片球菌冷冻干燥制剂的空白，解决乳酸片球菌菌株应用于大规模工业化生产困难的问题。本专利技术是通过如下技术方案实现的:，包括如下步骤:(I)活化乳酸片球菌PA003菌种于液体MRS培养基中，利用生长培养基进行培养，使其活性及存活性最佳；(2)利用冷冻离心机离心法收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮于已灭菌的冷冻干燥保护剂培养基中，通过逐步冷冻法将溶液冷冻，待其结冰后准备进行冷冻干燥；(3)将结冰样品放置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥；最后获得的冷冻干燥制剂密封避光放置于室温下贮藏。所述步骤(1)中生长培养基为10%(w/v)脱脂奶作为溶液基质的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基。所述MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基配方是指将葡萄糖0.66%，果糖0.66%，蔗糖0.66%代替MRS培养基`配方的葡萄糖2%。所述步骤(1)中接种量为1%，培养温度37°C，培养时间14h。所述步骤(2)冷冻干燥保护剂培养基为5%蔗糖的10%(w/v)脱脂奶溶液。所述步骤(2)冷冻离心机转速1000Orpm,在4°C下离心lOmin。所述步骤(3)冷冻干燥温度-53°C，冷冻干燥时间24h。一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的使用方法，使用时利用生理盐水作为复性液在22°C下进行复性30min。本专利技术的有益效果为:本专利技术利用改良后的MRS培养基，该乳酸片球菌的生长能达到最佳。用本专利技术制备的乳酸片球菌存活率高达81.96%，复性后具有乳酸菌属的发酵特性的同时仍保持对单核增多症李斯特氏菌的抑菌活性，适于开发后大规模工业化生产，在食品业和饲料业中作为生物防腐剂或是饲料添加剂使用具有很大的潜力。【附图说明】图1不同糖类(基质为蒸馏水)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；图2不同糖类(基质为10% (w/v)脱脂奶)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；图3不同大分子聚合物(基质为蒸馏水)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；图4不同大分子聚合物(基质为10% (w/v)脱脂奶)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；图5不同多元醇(基质为蒸馏水)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；图6不同多元醇(基质为10% (w/v)脱脂奶)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；图7其他化合物(基质为蒸馏水)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；图8其他化合物(基质为10% (w/v)脱脂奶)在各自不同浓度下作为冷冻干燥保护剂时乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂的存活率；图9a复性液对乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率的影响；图9b复性液对乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率的影响；图10复性温度对乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率的影响；图11复性时间对乳酸片球菌PA003冷冻干燥制剂存活率的影响；图12乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂抑制单核增多症李斯特氏菌CVCC1595的抑菌活性。【具体实施方式】下面结合附图对本专利技术作详细说明。实施例1制备乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂(I)将贮藏于4°C下MRS斜面上的乳酸片球菌PA003菌种按1%的接种量接种于液体MRS培养基中，接种后于37°C下培养14h，将液体MRS菌悬液再按1%的接种量接种于液体生长培养基中，放置于37°C下培养14h。(2)利用冷冻离心机离心(10000rpm,4°本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）活化乳酸片球菌PA003菌种于液体MRS培养基中，利用生长培养基进行培养，使其活性及存活性最佳；（2）利用冷冻离心机离心法收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮于已灭菌的冷冻干燥保护剂培养基中，通过逐步冷冻法将溶液冷冻，待其结冰后准备进行冷冻干燥；（3）将结冰样品放置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥；最后获得的冷冻干燥制剂密封避光放置于室温下贮藏。

【技术特征摘要】
1.一种乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)活化乳酸片球菌PA003菌种于液体MRS培养基中，利用生长培养基进行培养，使其活性及存活性最佳； (2)利用冷冻离心机离心法收集菌体，洗涤后，将菌体悬浮于已灭菌的冷冻干燥保护剂培养基中，通过逐步冷冻法将溶液冷冻，待其结冰后准备进行冷冻干燥； (3)将结冰样品放置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥；最后获得的冷冻干燥制剂密封避光放置于室温下贮藏。2.根据权利要求1所述乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中生长培养基为10%(w/v)脱脂奶作为溶液基质的MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基。3.根据权利要求2所述乳酸片球菌菌株冷冻干燥制剂的制备方法，其特征在于，所述MRS-葡萄糖-果糖-蔗糖培养基配方是指将葡萄糖0.66%，果糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩烨，洪小迪，谭茜倩，周志江，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：