本发明专利技术公开了小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入结构域MuαL?Id的抗体J7的筛选方法，它包括以下步骤：1）将目标蛋白展示于酵母细胞表面，得到表面展示有抗原多肽的酵母细胞；2）在酵母细胞表面表达不相关蛋白，然后与噬菌体抗体库共同孵育，以除去非特异性噬菌体；3）将酵母细胞与噬菌体抗体库共同孵育，使展示于所述酵母细胞表面的抗原和展示于所述噬菌体表面的抗体之间发生特异性的相互配对，得到所述酵母细胞与所述噬菌体的特异性结合物；4）从结合物中分离得到特异性结合的抗体或其编码基因。本发明专利技术可以高效快速地筛选高度保守的MuαL?Id单克隆抗体J7。
【技术实现步骤摘要】
小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入结构域mu a L Id的抗体J7的筛选方法
本专利技术涉及一种构建酵母表面双杂交系统筛选小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入结构域Mu a L Id的抗体J7的方法。
技术介绍
酵母表面展示是将外源蛋白表达于酵母体内并通过酵母表达凝集素的特殊结构将其携带至细胞表面的一种技术(Boder and Wittrup, 1997)。自然条件下酵母有a型和α型两种交配类型，这两类酵母交配依靠其细胞表面的凝集素，其中a型含有凝集素Agal和Aga2两个蛋白亚基。已知Agal共价连接于酵母表面的β _葡聚糖,而Aga2又与Agal之间形成两对二硫键(Cappellaro et al., 1991 ；Chen et al.，1995)。注意到这个现象,Boder和Wittup等将Agal蛋白整合到酵母基因组，并用一个质粒载体以Gall启动子表达Aga2和外源基因的融合蛋白。因此在半乳糖诱导下，外源基因便以融合蛋白的形式随Aga2转移到酵母表面。由于融合蛋白被共价地展示于细胞表面，可以方便地用外源蛋白的受体或抗体，或置于外源蛋白前或后的寡肽的通用抗体来检测蛋白的表达，借助常用的流式细胞仪，可快速定量检测外源蛋白与受体间的亲和力。酵母表面双杂交系统，是通过分泌途径来分析蛋白互作的一个平台，这种系统是在酵母表面展示系统的基础 上发展起来的，优点在于无需蛋白表达纯化，在酵母体内同时表达这两个蛋白并最终展示于酵母表面。在YSD基础上酵母表面展示一个外源蛋白X，另一个蛋白Y则以分泌的形式表达，如果X能结合Y，那么Y则可以与X —起附于酵母表面，利用Y或与Y融合的寡肽的抗体来检测他们的亲和性，并且X和Y之间的亲和性可以通过流式细胞仪定量(Hu，.et al.，2009)。这种技术的创新性在于:①首创Gall和GallO启动子的联用。②建立利用酵母蛋白分泌途径的蛋白-蛋白相互作用体系。③本系统无需蛋白纯化即可进行蛋白的定向进化以及文库受体筛选。淋巴细胞功能相关抗原-1(lymphocyte function associated anti gen-1, LFA-1)属于整合素家族，整合素是一类重要的细胞黏附分子，是由α和β两个亚基通过非共价键组成的异源二聚体，整合素可以通过其胞内区与胞内的细胞骨架蛋白和信号分子结合，通过由内到外(inside-out)和由外到内(outside-1n)双向传递跨膜信号(Abrams,et al.,2010) ?这些过程伴随着整合素对其配体亲和力的改变。整合素的这些特性对于生物体的免疫反应、细胞迁移、免疫细胞的组织定位、凝血、组织愈伤、组织和器官的发育，甚至神经系统的正常功能等都至关重要。LFA-1作为整合素的一员具有同样的特性(Bon G.etal.2007),LFA-1通过与其配体ICAM-1结合，促进炎症细胞之间的黏附及炎症细胞向局部的趋化反应，从而促进疾病的发生发展。抗LFA-1的抗体对淋巴细胞从外周血向淋巴结的迁移可以有明显的干扰作用。筛选抗LFA-1抗体对于检测LFA-1的水平和阻断LFA-1与其配套ICAM-1的结合从而抑制相关疾病的发生发展具有重要作用。Mua L Id (小鼠整合素蛋白LFA-1份子的插入结构域)就属于这个家族的一员，筛选这个物质的抗体对于一些疾病的防治和靶标用药具有重要作用。传统制备抗体的方法是通过人工免疫或杂交瘤细胞得到，这种方法制备的抗体特异性差，并且费时费力，制备可溶性抗原过程中会不同程度破坏抗原的天然构象，通过传统方法制备的抗体与抗原之间的亲和力大小不能被定量测定。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效快速筛选Mu a L Id抗体J7的方法。上述目的通过以下技术方案实现:一种Mu a L Id抗体J7的筛选方法，包括以下步骤:I)将小鼠整合素蛋白LFA-1份子的插入结构域(MuaL Id)展示于酵母细胞ΕΒΥ100表面，得到表面展示有Mu a L Id的酵母细胞，展示在酵母表面的蛋白结构包括MuaL Id胞外域、Myc标签和Aga2的N端到C端区域，然后用流式细胞仪检测蛋白是否表达；2)在酵母细胞EYB100表面表达不相关蛋白Zif268，然后与噬菌体抗体库共同孵育，以除去非特异性噬菌体，得到表达特异性抗体的噬菌体；3)将步骤I)得到的表面展示有Mua L Id抗原的酵母细胞与除去非特异性噬菌体后的噬菌体抗体库共同孵育，使展示于所述酵母细胞表面的抗原和展示于噬菌体表面的抗体发生特异性的结合，得到所述酵母细胞与所述噬菌体的特异性结合物，将所述结合物从孵育体系中分离出来；4)从步骤3)得到的结合物中分离得到与展示于酵母细胞表面的Mu a L Id抗原特异性结合的噬菌体，并转入到宿主细菌Escherichia coli (TGl)，并提取质粒，测序；将质粒转化到细菌HB2151并表达纯化单链抗体即scFv片段，用纯化蛋白进一步检测其与表达有抗原的酵母结合力。5)将单链抗体即scFv片段转化为抗体全基因片段，即scFv-Fc。其中，步骤I)中所述的将Mua L Id展示于酵母细胞EBY100表面是按以下方法实现的:将含有MuaL Id编码基因的重组表达载体转入所述酵母细胞EBY100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达(方法按Hu，et al.，2009)，得到所述表面展示有目标蛋白的酵母细胞。其中，步骤I)中所述的流式细胞仪检测，其方法如下:1)吸3ul表达有抗原的酵母细胞于96孔板中,取未表达蛋白的酵母2ml于离心管中做对照，混匀后离心。向每个孔中加IOOul标记缓冲液(PBS+0.5%BSA+lmM MgCl2)，混匀后离心(4°C，2min, 2800rpm)使细胞沉淀，去上清。吸净标记缓冲液，每孔加20ull0ug/ml的一抗即小鼠抗Myc抗体(9E10)。加入200ul标记缓冲液(PBS+0.5%BSA+lmM MgCl2), 30°C振荡培养Ih。2)用标记缓冲液(PBS+0.5%BSA+lmM MgCl2)冲洗细胞，离心(4 V，2min，2800rpm)弃上清，然后加入二抗即山羊藻红蛋白共轭抗鼠抗体，加入200ul的标记缓冲液(PBS+0.5%BSA+lmM MgCl2)室温培养 Ih。3)用标记缓冲液(PBS+0.5%BSA+lmM MgCl2)冲洗细胞，离心(4°C，2min, 2800rpm)弃上清，然后将细胞在200ul标记缓冲液(PBS+0.5%BSA+lmM MgCl2)中重悬，后即可用流式细胞仪检测。步骤2)中，所述的在酵母细胞表面表达不相关蛋白Zif268，然后与噬菌体抗体库共同孵育，以除去非特异性噬菌体是按以下步骤实现的:1)2χ10~ 13个噬菌体克隆先在含有2%的脱脂奶粉的PBS溶液中室温培养30min。2)然后向I)中加入2xl0~7个表达不相关蛋白Zif268的酵母细胞EYB100，两种细胞的混合液在搅拌下室温培养lh。3)未结合在酵母细胞表面的噬菌体克隆通过离心作用留在上清液中，离心后取上清液。4)将上清液加入酵母细胞EYB100，离心后去上清，然后用PBS和0.05%吐温20将菌块洗5次。5)用胰蛋白酶处理将噬菌体从酵母细胞表面洗脱下来，本文档来自技高网...
【技术保护点】
小鼠整合素蛋白LFA?1分子插入结α构域MuαL?Id的抗体J7的筛选方法，其特征在于包括以下步骤：1）将MuαL?Id展示于酵母细胞EBY100表面，得到表面展示有MuαL?Id抗原的酵母细胞，展示在酵母表面的蛋白结构包括MuαL?Id胞外域、Myc标签和α半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，然后用流式细胞仪检测蛋白是否表达；2）在酵母细胞EYB100表面表达不相关蛋白，然后与噬菌体抗体库共同孵育，以除去非特异性噬菌体，得到表达特异性抗体的噬菌体；3）将步骤1）得到的表面展示有MuαL?Id抗原的酵母细胞与除去非特异性噬菌体后的噬菌体抗体库共同孵育，使展示于所述酵母细胞表面的抗原和展示于噬菌体表面的抗体发生特异性的相互配对，得到所述酵母细胞与所述噬菌体的特异性结合物，将所述结合物从孵育体系中分离出来；4）从步骤3）得到的结合物中分离得到与展示于酵母细胞表面的MuαL?Id抗原特异性结合的噬菌体，并转入到宿主细菌Escherichia?coli，提取质粒，测序；将质粒转化到细菌HB2151并表达、纯化单链抗体scFv片段，用纯化蛋白进一步检测其与表达有抗原的酵母结合力；5)将单链抗体即scFv片段转化为抗体全基因片段，即scFv?Fc。...
【技术特征摘要】
1.小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入结α构域MuaL Id的抗体J7的筛选方法，其特征在于包括以下步骤: I MfMuaL Id展示于酵母细胞EBYlOO表面，得到表面展示有Mu a L Id抗原的酵母细胞，展示在酵母表面的蛋白结构包括Mu a L Id胞外域、Myc标签和a半乳糖苷酶Aga2基因的N端到C端区域，然后用流式细胞仪检测蛋白是否表达； 2)在酵母细胞EYB100表面表达不相关蛋白，然后与噬菌体抗体库共同孵育，以除去非特异性噬菌体，得到表达特异性抗体的噬菌体； 3)将步骤I)得到的表面展示有Mua L Id抗原的酵母细胞与除去非特异性噬菌体后的噬菌体抗体库共同孵育，使展示于所述酵母细胞表面的抗原和展示于噬菌体表面的抗体发生特异性的相互配对，得到所述酵母细胞与所述噬菌体的特异性结合物，将所述结合物从孵育体系中分离出来； 4)从步骤3)得到的结合物中分离得到与展示于酵母细胞表面的Mua L Id抗原特异性结合的曬菌体，并转入到宿主细菌Escherichia coli,提取质粒,测序；将质粒转化到细菌HB2151并表达、纯化单链抗体scFv片段，用纯化蛋白进一步检测其与表达有抗原的酵母结合力； 5)将单链抗体即scFv片段转化为抗体全基因片段，即scFv-Fc。2.根据权利要求1所述的小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入结构域MuaL Id的抗体J7的筛选方法，其特征在于:步骤I)中所述的将Mu a L Id展示于酵母细胞ΕΒΥ100表面是按以下方法实现的:将含有Mua L Id编码基因的重组表达载体转入所述酵母细胞ΕΒΥ100中，得到重组酵母细胞，培养该重组酵母细胞并诱导所述重组载体的表达。3.根据权利要求1所述的小鼠整合素蛋白LFA-1分子插入结构域MuaL Id的抗体J7的筛选方法，其特征在于:步骤2)中所述的在酵母细胞表面表达不相关蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡学博，胡延如，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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