一种利那洛肽的制备方法技术

本发明专利技术属于药物合成技术领域，公开了一种采用完全选择性形成三对二硫键合成利那洛肽的方法。使用本发明专利技术的工艺，可以在同一个溶液体系中，依次完成利那洛肽中三对二硫键的形成，因此该工艺的操作方法相当简单，同时也大大提高利那洛肽最终精肽的收率，并且可以实现大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种利那洛肽的制备方法
本专利技术涉及药物合成
，具体涉及一种利那洛肽的制备方法。
技术介绍
利那洛肽，英文名称为Linaclotide；商品名称为Linzess；中文通用名称为利那洛肽。其为一种GC-C(肠上皮细胞尿苷酸环化酶C)受体激动剂，2012年8月美国FDA批准用于治疗成人慢性特发性便秘和便秘型肠易激综合症(IBS-C)。该药物由Ironwood制药公司开发，化合物结构为14个氨基酸组成的含有三对二硫键的多肽(三对二硫键分别为：1-6；2-10和5-13)，可以通过细胞表达和化学合成制得，具体肽序如下式所示：目前，针对利那洛肽尚没有比较高效的制备方法，也未见相关的已经授权的专利报道。有关其合成方法，只有Benitez等人2010年进行了相关的报道(参见PeptideScience,2011,96:69-80)。该文献中采用三种方法对利那洛肽进行尝试性合成。方法一：采用Trt为Cys的侧链保护基团，用Fmoc固相肽合成方法完成线性肽的合成，得到粗肽后用液相氧化的方法一步氧化得到目标肽。方法二：采用Trt和Acm为Cys侧链保护基团，Fmoc固相肽合成方法得到部分保护的线性肽，然后用半选择的策略完成二硫键的合成。方法三：分别采用[2Mmt+2Acm+2Trt]、[2Acm+2Trt+2pMeOBzl]、[2StBu+2Trt+2pMeOBzl]三种完全选择性策略合成利那洛肽。方法一中，虽然合成步骤简单，只使用了一种Cys的保护基团。但是，对于需要定位形成三对二硫键的肽来说，随机氧化会得到许多种不同的异构体，尽管可以通过一些缓冲溶液体系来使得氧化过程中尽可能大的转变为目标分子，但是始终无法避免其他异构体的产生。这种操作容易使得目标肽粗肽纯化困难，收率不高，很难进行大规模生产。同时，采用该方法进行氧化，对外界条件比如温度等的依赖性也非常高，在不同的环境下，自然氧化所得到的产品收率相差也非常大，不利于产品质量的控制。方法二为一种半选择性定位氧化的方法，相对于方法一，定位氧化了一对二硫键，降低了形成不同异构体形成的数量，但是同样无法避免异构体的产生。同时，论文中也直接提到，采用碘氧化形成两对二硫键，粗肽收率将严重下降。方法三中，研究者选择采用三种不同的完全选择性形成三对二硫键。第一组实验，[2Mmt+2Acm+2Trt]策略最终的结果是无法得到目标产物；[2Acm+2Trt+2pMeOBzl]方法的结果同样非常不理想，最终失败；[2StBu+2Trt+2pMeOBzl]方法，研究者最终还是没有得到目标产物，同时得出结论利那洛肽无法采用完全选择性形成三对二硫键。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述缺陷，提供了一种采用完全选择性形成三对二硫键合成利那洛肽的方法。使用本专利技术工艺，可以在同一个溶液体系中，依次完成利那洛肽中三对二硫键的形成，因此该工艺的操作方法相当简单，同时也大大提高利那洛肽最终精肽的收率，并且可以实现大规模生产。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种利那洛肽的制备方法，包括如下步骤：1、Fmoc-Tyr(tBu)-树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-树脂；2、利那洛肽肽树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得利那洛肽肽树脂，其中1-6位的Cys侧链采用Hqm保护，2-10位的Cys侧链采用Trt保护，5-13位的Cys侧链采用Acm保护；3、利那洛肽线性肽粗肽的制备：利那洛肽肽树脂经裂解反应，获得带有Acm保护基团及Hqm保护基团的线性肽粗肽；4、利那洛肽2-10位第一对二硫键的形成：氧气氧化得到2-10位成环的第一对二硫键；5、利那洛肽Hqm保护基团的脱除及1-6位第二对二硫键的形成：加入水合肼，脱除Hqm保护基团的同时形成第二对二硫键；6、利那洛肽5-13位第三对二硫键的形成：加入碘和醋酸，形成第三对二硫键；7、纯化和冻干后获得利那洛肽精肽。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，步骤1中的载体树脂优选为WangResin。在进一步优选的实施方案中WangResin的替代度为0.2～1.2mmol/g，更加优选为0.3～1.0mmol/g，最优选为0.6～0.8mmol/g。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，所采用的具有Fmoc保护基团的氨基酸分别为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Hqm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH和Fmoc-Glu(OtBu)-OH。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，步骤1中的偶联体系为HOBt/DIC/DMAP，HOBt/DCC/DMAP，HOAt/DIC/DMAP，HBTU/HOBt/DIPEA，TBTU/HOBt/DIPEA，PyBOP/HOBt/DIPEA。在本专利技术优选的实施方案中，步骤1中的偶联体系优选为HOBt/DIC/DMAP或HBTU/HOBt/DIPEA。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，步骤2中逐一偶联的方式采用的偶联试剂为DIC+A或B+A+C，其中A为HOBt或HOAt；B为HBTU、HATU、TBTU或PyBOP，C为DIPEA或TMP。在本专利技术优选的实施方案中，步骤2中逐一偶联的方式采用的偶联试剂优选为HOBt+DIC或HOBt+HBTU+DIPEA。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，步骤3中的裂解试剂为三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷TIS、1,2-乙二硫醇EDT、苯酚PhOH和水组成的混合试剂。在本专利技术优选的实施方案中，裂解试剂中各组分的体积比优选为TFA:TIS:EDT:PhOH:H2O＝85-95:2-5:0-3:0-2:1-5，更加优选为TFA:TIS:EDT:PhOH:H2O＝90:3:2:1:4或TFA:EDT:H2O＝90:5:5。在本专利技术优选的实施方案中，裂解时间优选为1.5-3.5小时。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，步骤4中2-10位形成第一对二硫键优选采用的是带Acm和Hqm保护基团肽的水溶液，溶液的浓度为0.1-2mg肽/ml，优选浓度为0.1-1mg肽/ml，用氨水调节pH为7.0，往其中通入氧气进行氧化，氧化时间为4小时。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，步骤5中选择性脱除Hqm保护基团同时形成1-6位第二对二硫键优选采用的是往上述水溶液中加入5％的水合肼，用醋酸和氨水调节pH＝8.5，空气下氧化反应，反应时间为5-44小时，优选为10-24小时。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，步骤6中5-13位形成第三对二硫键优选采用的是往上述水溶液加入相当于肽的5-40倍当量的碘，优选10-30倍当量，然后加入水溶液体积20％的醋酸，氧化时间为0.2-1小时，优选为0.2-0.5小时。在本专利技术制备利那洛肽的方法中，步骤7中的纯化优选采用反相高效液相色谱进行纯化。与已有技术相比，本专利技术工艺采用完全选择定位形成三对二硫键的方法完成利那洛肽的合成，同时所有三对二硫键在同一溶液中逐步形成，具有反应操作简单、后处理容易、原料简单本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利那洛肽的制备方法，包括如下步骤：1）Fmoc?Tyr(tBu)?树脂的制备：Fmoc?Tyr(tBu)?OH和载体树脂反应，获得Fmoc?Tyr(tBu)?树脂；2）利那洛肽肽树脂的制备：Fmoc?Tyr(tBu)?树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得利那洛肽肽树脂，其中1?6位的Cys侧链采用Hqm保护，2?10位的Cys侧链采用Trt保护，5?13位的Cys侧链采用Acm保护；3）利那洛肽线性肽粗肽的制备：利那洛肽肽树脂经裂解反应，获得带有Acm保护基团及Hqm保护基团的线性肽粗肽；4）利那洛肽2?10位第一对二硫键的形成：氧气氧化得到2?10位成环的第一对二硫键；5）利那洛肽Hqm保护基团的脱除及1?6位第二对二硫键的形成：加入水合肼，脱除Hqm保护基团的同时形成第二对二硫键；6）利那洛肽5?13位第三对二硫键的形成：加入碘和醋酸，形成第三对二硫键；7）纯化和冻干后获得利那洛肽精肽。

【技术特征摘要】
1.一种利那洛肽的制备方法，包括如下步骤：1)Fmoc-Tyr(tBu)-树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-树脂；2)利那洛肽肽树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得利那洛肽肽树脂，其中1-6位的Cys侧链采用Hqm保护，2-10位的Cys侧链采用Trt保护，5-13位的Cys侧链采用Acm保护；3)利那洛肽线性肽粗肽的制备：利那洛肽肽树脂经裂解反应，获得带有Acm保护基团及Hqm保护基团的线性肽粗肽，裂解试剂为三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷TIS、1,2-乙二硫醇EDT、苯酚PhOH和水组成的混合试剂，混合试剂中各组分的体积比为TFA:TIS:EDT:PhOH:H2O＝85-95:2-5:0-3:0-2:1-5，裂解时间为1.5-3.5小时；4)利那洛肽2-10位第一对二硫键的形成：采用带Acm和Hqm保护基团肽的水溶液，溶液的浓度为0.1-2mg肽/ml，往其中通入氧气进行氧化，得到2-10位成环的第一对二硫键；5)利那洛肽Hqm保护基团的脱除及1-6位第二对二硫键的形成：加入水溶液体积5％的水合肼，脱除Hqm保护基团的同时形成第二对二硫键；6)利那洛肽5-13位第三对二硫键的形成：往水溶液加入相当于肽的5-40倍当量的碘，然后加入水溶液体积20％的醋酸，形成第三对二硫键；7)纯化和冻干后获得利那洛肽精肽。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤3)中混合试剂中各组分的体积比为TFA:TIS:EDT:PhOH:H2O＝90:3:2:1:4或TFA:EDT:H2O＝90:5:5。3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤1)中的载体树脂为WangResin，WangResin的替代度为0.2～1.2mmol/g。4.根据权利要求3所述的方法，其中步骤1)中的载体树脂为WangResin，WangResin的替代度为0.3～1.0mmol/g。5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤1)中的载体树脂为WangResin，WangResin的替代度为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：戴政清，刘剑，马亚平，袁建成，
申请(专利权)人：深圳翰宇药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：