多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物及其制备方法，该共轭组合物是由14种不同血清型的肺炎链球菌荚膜多糖和载体蛋白质共价连接形成的共轭组合物，其中，14种不同血清型为1、3、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。该共轭组合物吸附效果及稳定性好，具有针对上述14种血清型的肺炎球菌侵袭的多重免疫原性和保护性能，优于已上市的低价次肺炎组合物，且免疫应答高于未结合的组合物。接种含有该共轭组合物的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗可以减少接种针次，简化免疫程序，同时可有效预防人及动物因上述14种血清型肺炎球菌所致的疾病，覆盖更加广泛，免疫效果更好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物学及免疫学领域，具体地说，涉及一种。
技术介绍
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)可引起脑膜炎、肺炎等侵入性疾病和中耳炎等非侵入性疾病。据联合国统计数据显示，每年有超过一百万的两岁以下儿童死于肺炎球菌引起的疾病。目前，针对肺炎链球菌的主要防御手段为多糖疫苗和结合疫苗，已经证实了前者在成年人中的保护效果，但是对于肺炎链球菌的主要易感人群，婴儿和幼儿中的保护力却很弱。结合疫苗因其可以在婴幼儿中引起有效保护和免疫记忆，自2000年首次问世以来，在全世界许多国家被纳入免疫计划或批准上市。目前我国仅有7价肺炎球菌结合疫苗Prevnar?被批准上市，仅能保护7个价次，保护范围有限，而象其他10价肺炎球菌结合疫苗Synflorix?，13价肺炎球菌结合疫苗Prevenar 13v?其血清型组合主要针对欧美发达国家流行情况而设计，对我国特有的血清型缺乏保护。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物、其制备方法及应用。本专利技术的另一目的是提供一种含有上述共轭组合物的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，其是由14种不同血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖和载体蛋白质共价连接形成的共轭组合物；其中，所述14种不同血清型为1、3、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F。前述的多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，荚膜多糖与载体蛋白质的质量比为1:2-2:1，各血清型荚膜多糖的质量为血清型1:血清型3:血清型4:血清型5:血清型6A:血清型9V:血清型14:血清型18C:血清型19A:血清型19F:血清型22F:血清型23F:血清型 33F:血清型 6Β=1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2ο前述的多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，所述载体蛋白质应为无毒性，且能与肺炎荚膜多糖结合并且能够引起多糖免疫原性显著升高的蛋白质，同时易于大量获得。本专利技术的载体蛋白质优选为白喉类毒素或破伤风毒素，更优选为白喉类毒素CRM197。上述蛋白质载体的获得，需经过菌体发酵、超滤、纯化、脱毒等步骤，均为本领域常规技术。本专利技术还提供制备所述多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物的方法，分别对 14 种不同血清型(1、3、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F)肺炎链球菌的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各血清型荚膜多糖分别与载体蛋白质进行共价连接(例如，先将纯化的荚膜多糖化学活化，通过还原胺化法将活化荚膜多糖分别单独结合到载体蛋白上)，形成单价共轭物，最后将各型单价共轭物混合，即得多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物。其中，肺炎链球菌荚膜多糖分离纯化的步骤为:I)建立肺炎球菌菌种库，采用工作种子进行肺炎球菌发酵；2)向肺炎球菌发酵液中加入适量的去氧胆酸钠进行杀菌并剥离肺炎荚膜多糖；3)对杀菌后的发酵液进行离心，去除菌体，收集离心上清，然后进行超滤浓缩；4)向浓缩液中加入无水乙醇，使乙醇终浓度为25%~45%,搅拌后离心去除核酸；5)向上清中加入乙醇使其终浓度达到55%~80%，搅拌后，离心，去除上清收集沉淀；6)加水溶解沉淀，加入1-3倍溶液体积的苯酚进行多次抽提，去除蛋白；7)向上清中加入乙醇，使其终浓度达到55%~80%，离心后收集沉淀，即得纯化的肺炎球菌荚膜多糖。还可采用本领域熟知的其它纯化技术，如柱层析等方法对肺炎链球菌荚膜多糖进行纯化。 本专利技术还提供所述多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物在制备用于预防或治疗肺炎链球菌所致疾病的药物中的应用。本专利技术进一步提供一种多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗，其含有所述多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，以及任选赋形剂和/或基于铝的佐剂。所述基于铝的佐剂，如氧化铝、氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等。所述基于铝的佐剂可市售获得，也可以采用本领域常规方法进行制备，所述赋形剂优选氯化钠和/或琥珀酸等。前述的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗中，基于铝的佐剂其终浓度为0.125-2.0mg/ml。前述的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗，其可以为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊剂、片剂或丸剂等。可通过以下方式进行免疫:皮肤、注射(包括皮下注射、肌肉注射、静脉注射)、口服、滴鼻或粘膜喷雾等。所述多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法包括:将各型单价共轭物分别采用铝佐剂吸附后混合；或各型单价共轭物混合后再采用铝佐剂吸附，即得14价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗(14vPnC)。本专利技术的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗可以用于保护或者治疗由于肺炎球菌感染引发肺炎的病人，疫苗可以通过肌肉、皮下、皮内途径注射或经过粘膜给药。该多价结合疫苗适于接种2、4、6和12-15个月龄的婴幼儿，也更适合于儿童、青年和成人。本专利技术是针对我国特有血清型肺炎球菌的流行情况，创造性的选择了 1、3、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的血清型组合，从而开发出针对我国特有血清型肺炎球菌的流行情况而设计的多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，在严格控制载体蛋白含量从而减少免疫抑制作用的前提下，提供最大限度的保护。采用本专利技术方法制备的多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，其吸附效果及稳定性较好。该共轭组合物具有针对上述14种血清型的肺炎球菌侵袭的多重免疫原性和保护性能，优于已上市的低价次肺炎组合物，且免疫应答高于未结合的组合物。接种本专利技术的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗可以减少接种针次，简化免疫程序，同时可有效预防人及动物因上述14种血清型肺炎球菌所致的疾病，覆盖更加广泛，免疫效果更好。另外，该多价结合疫苗免疫原性效果远高于同类多价次的多糖类疫苗，可有效激活2岁以下儿童B细胞，从而产生抗体，并激活记忆B细胞，诱发免疫记忆反应，可以起到更好的保护效果。本专利技术的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗可以由预防上述14种血清型肺炎球菌所致的侵袭性疾病，更加方便多效，成本更低。上述14种血清型荚膜多糖的生产，均采用发酵后纯化的方式进行制备，具有相似的生产工艺，便于工业化大规模生产，且通过灭活后提纯荚膜多糖，使疫苗具有更高的安全性及良好的免疫原性，同时，所述多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物吸附完全，理化性质稳定，互无干扰。动物实验表明，本专利技术的多价肺炎球菌荚膜多糖结合疫苗可有效诱导机体产生针对上述14种血清型荚膜多糖的高滴度、特异性抗体，体外实验表明，由该多价结合疫苗所诱导的抗体具有明显的反应性与中和活性；特别是组合物中各血清型荚膜多糖的免疫效果不受另一组分的影响与干扰，吸附率大于75%，免疫原性不低于单价共轭物。该多价结合疫苗具有与各血清型单价结合原液相同的免疫原性，组合接种可以在不影响疗效的基础上大大减少接种次数。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1肺炎球菌荚膜多糖原液制备1、3、4、5、6A、6B本文档来自技高网...

【技术保护点】
多价肺炎球菌荚膜多糖?蛋白质共轭组合物，其特征在于，其是由14种不同血清型肺炎链球菌（Streptococcus?pneumoniae）荚膜多糖和载体蛋白质共价连接形成的共轭组合物；其中，所述14种不同血清型为1、3、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。

【技术特征摘要】
1.多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白质共轭组合物，其特征在于，其是由14种不同血清型肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)荚膜多糖和载体蛋白质共价连接形成的共轭组合物；其中，所述 14 种不同血清型为 1、3、4、5、6A、6B、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F 和 33F。2.根据权利要求1所述的共轭组合物，其特征在于，荚膜多糖与载体蛋白质的质量比为1:2-2:1，各血清型荚膜多糖的质量为血清型1:血清型3:血清型4:血清型5:血清型6A:血清型9V:血清型14:血清型18C:血清型19A:血清型19F:血清型22F:血清型23F:血清型 33F:血清型 6Β=1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:1:2ο3.根据权利要求1所述的共轭组合物，其特征在于，所述载体蛋白质为白喉类毒素或破伤风类毒素。4.根据权利要求3所述的共轭组合物，其特征在于，所述载体蛋白质为白喉类毒素CRM197。5.制备权利要求1-4任一项所述共轭组合物的方法，其特征在于，分别对14种不同血清型肺炎链球菌的荚膜多糖进行分离纯化，然后将各血清型荚膜多糖分别与载体蛋白质进行共价连接，形成单价共轭物，最后将各型单价共轭物混合，即得多价...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩星，蔡芳，王新立，王治伟，王见冬，高强，尹卫东，
申请(专利权)人：北京科兴中维生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：