本发明专利技术公开一种检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ-间接ELISA抗体检测试剂盒及应用。本发明专利技术试剂盒包括如下组成：以纯化的JEV-EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板、洗涤液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、底物显色液、终止液、JEV阳性血清、JEV阴性血清。本发明专利技术使用的包被抗原易于稳定、大量获得，纯化方法简单易于实现，重组蛋白的浓度易于测定和控制，有利于工业化大量生产。本发明专利技术试剂盒用于检测猪乙型脑炎病毒抗体，与现有技术中ELISA试剂盒的检测符合率为90%。本发明专利技术试剂盒便于操作，灵敏度高，特异性好，使用成本低，重复性好，适合推广应用，为临床上快速检测JEV抗体提供了可靠手段。
【技术实现步骤摘要】
检测猪乙型脑炎病毒的E II1-间接ELISA抗体检测试剂盒及应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测猪乙型脑炎病毒的EII1-间接ELISA抗体检测试剂盒及应用。
技术介绍
日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)属于黄病毒科黄病毒属，其所导致的日本乙型脑炎是一种中枢神经系统性人畜共患的急性传染病。据估计，每年全球大约有50000人感染JEV，大约有15000例死亡，死亡率30%左右；同时JEV是严重危害养猪业的重要病毒之一，给养猪业造成巨大的经济损失，极大的限制肉产品的出口创汇。2008年我国农业部将猪日本乙型脑炎病归于二类动物疫病。该病于19世纪70年代在日本首次报道，并于1924年首次分离到日本乙型脑炎病毒。中国是在1938?1940年间采用血清学和病毒分离的方法确诊了日本乙型脑炎病例，于1949年在北京首次分离到该病毒。自20世纪90年代以来，该病的流行区域有所扩大，目前该病的分布区北起俄罗斯西伯利亚、日本北海道，南到澳大利亚，东到美国关岛，西到印度西海岸。亚洲是JE发病人数最多的地区，我国又占了其中的大多数。目前常用于检测乙脑病毒的方法包括病原的分离鉴定、RT-PCR和血清学方法。病原的分离鉴定是最传统的检测方法，其结果准确可靠，但其影响因素多，实际操作起来相当费时费力，因此在临床应用中有一定的局限性；RT_PCR技术需要特殊的仪器设备(如PCR仪和凝胶成像系统等)和专业人员进行相关的操作；酶免疫分析法是血清学方法中最常用的方法之一，而酶免疫分析法将酶催化反应的放大作用和抗原抗体亲和反应的高度专一性、特异性相结合，以酶标记的抗原或抗体作为主要试剂进行免疫测试，具有很高的灵敏度和特异性，但是，免疫分析法的灵敏度、特异性取决于抗原的选择。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种检测猪乙型脑炎病毒的E II1-间接ELISA抗体检测试剂盒。该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、操作方法简单的特点。本专利技术的另一目的在于提供所述的检测猪乙型脑炎病毒的E II1-间接ELISA抗体检测试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现:一种检测猪乙型脑炎病毒的E II1-间接ELISA抗体检测试剂盒,具体包括如下组成:以纯化的JEV-E III蛋白作为包被抗原的酶标板、洗涤液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、底物显色液、终止液、JEV阳性血清、JEV阴性血清。所述的纯化的JEV-E III蛋白通过以下步骤制备得到:(I)从猪乙型脑炎病毒GZ0409-31株中抽提RNA，42°C反转录Ih后，获得cDNA，以获得的cDNA为模板，通过引物Pl和P2进行PCR ;将得到的PCR产物和载体pET_32a分别通过BamH I和HindIII进行双酶切；再将双酶切后的PCR产物和pET_32a连接，得到重组质粒 pET-32a-JEV-EIII ；Pl:5’-CGCGGATCCAAAAATCCGGCGGACACTG-3’ ；P2:5’-CCCAAGCTTTTACAAAGTTGTTGAAAAGGCCTTG-3’ ；其中，CGC或CCC为保护碱某,GGATCC为BamH I酶切位点，AAGCTT为Hind III酶切位点，TTA是终止密码子TAA的反向互补序列；(2)将重组质粒pET-32a_JEV-EIII转化入大肠杆菌中，将检测为阳性的重组菌株，通过IPTG进行诱导表达；(3)收集表达后的菌液，使用His-TRAP? FF Crude柱进行纯化，得到纯化的JEV-E III 蛋白；步骤(1)中所述的反转录的反应体系为:总1?嫩12 4 1^、(1见1^2 4 1^随机引物14 1^RRI2 μ L、AMVl μ L,加 ddH20 至总体积为 20 μ L ；步骤(1)中所述的PCR的反应体系为:10\8肛€6技41^，浓度为21111的(1见138541^浓度为 25mM 的 MgS044y L，引物 Pl 1.5 μ L，引物 P21.5 μ L, cDNA2 μ L，KOD 酶 I μ L，加 ddH20至 50 μ L ;步骤(1)中所述的PCR的反应条件为:94°C预变性2min ;94°C热变性15s、55°C 30s,68°C lmin，共 30 个循环；68°C 8min 终延伸；所述的以纯化的JEV-E III蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到:将纯化的JEV-E III蛋白用包被缓冲液稀释到4.7 μ g/mL, 100 μ L每孔加到酶标板，4°C过夜；取过夜包被好的酶标板，200 μ L/孔洗涤液洗板3~5次，每次3~5min ；200 μ L/孔封闭液，37°C温育2.5h，取封闭好的酶标板，200 μ L/孔洗涤液洗板3~5次，每次3~5min ；得到以纯化的JEV-E III蛋白作为包被抗原的酶标板；所述的包被缓冲液优选为pH9.6,0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；所述的PH9.6,0.05mol/L的碳酸盐缓冲液优选通过如下步骤制备得到:将碳酸钠1.5g和碳酸氢钠2.93g溶解于600mL ddH20,调pH值至9.6，ddH20定容至1000mL,即得包被缓冲液；所述的封闭液优选为用洗涤液配制的质量体积比(g/mL) 0.5%的大豆卵磷脂溶液；所述的酶标板优选为JET公司产品；所述的洗涤液通过如下步骤制备得到:将3.579g Na2HPO4.12H20、1.56gNaH2P04 *2H20,NaC129.215g 和 600mL ddH20 充分溶解，加入 0.5mL 吐温-20，用 IOmol/L HCl溶液调pH值至7.4，ddH20定容至1000mL ；所述的血清稀释液优选为用洗涤液配制的质量体积比(g/mL) 0.5%的大豆卵磷脂溶液；所述的兔抗猪酶标二抗优选为辣根过氧化物酶(HRP)-兔抗猪IgG 二抗；所述的底物显色液优选为TMB显色液；所述的终止液为2M硫酸；所述的检测猪乙型脑炎病毒的E II1-间接ELISA抗体检测试剂盒的应用，包含以下步骤:(I)将待检样品用血清稀释液稀释，然后按100 μ L/孔的量加到以纯化的JEV-EIII蛋白作为包被抗原的酶标板中，同时也将JEV阳性血清和JEV阴性血清分别按100 μ L/孔的量加到以纯化的JEV-E III蛋白作为包被抗原的酶标板中作为对照，37°C温育40min ；(2)用洗涤液进行洗板3次，200 μ L/孔，每次3min ；(3)将兔抗猪酶标二抗用洗涤液稀释，每个反应孔加100 μ L，37°C温育55min ；(4)用洗涤液进行洗板4次，200 μ L/孔，每次3min ；(5)避光条件下每个反应孔加100 μ L底物显色液，室温避光显色20min ；(6)每个反应孔加50 μ L终止液终止反应；(7 )在450nm单波长下测OD值；(8)结果判读:0D450nm(样本)≥0.255判为阳性；0D450nm介于0.231~0.255(0D450nm(样本)+2SD)判为可疑，0D450nm(样本)< 0.231判为阴性。步骤(1)中所述的将待检样品用血清稀释液稀释优选为将待检样品用血清稀释液按本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪乙型脑炎病毒的EⅢ?间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于包括如下组成：以纯化的JEV?EⅢ蛋白作为包被抗原的酶标板、洗涤液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、底物显色液、终止液、JEV阳性血清、JEV阴性血清。
【技术特征摘要】
1.一种检测猪乙型脑炎病毒的E II1-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于包括如下组成: 以纯化的JEV-E III蛋白作为包被抗原的酶标板、洗涤液、血清稀释液、兔抗猪酶标二抗、底物显色液、终止液、JEV阳性血清、JEV阴性血清。2.根据权利要求1所述的检测猪乙型脑炎病毒的EII1-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于: 所述的纯化的JEV-E III蛋白通过以下步骤制备得到: (1)从猪乙型脑炎病毒GZ0409-31株中抽提RNA，42°C反转录Ih后，获得cDNA，以获得的cDNA为模板，通过引物Pl和P2进行PCR ;将得到的PCR产物和载体pET_32a分别通过BamH I和HindIII进行双酶切；再将双酶切后的PCR产物和pET_32a连接，得到重组质粒pET-32a-JEV-EIII ；Pl:5，-CGCGGATCCAAAAATCCGGCGGACACTG-3’ ；P2:5’-CCCAAGCTTTTACAAAGTTGTTGAAAAGGCCTTG-3’ ； (2)将重组质粒pET-32a-JEV-EIII转化入大肠杆菌中，将检测为阳性的重组菌株，通过IPTG进行诱导表达； (3)收集表达后的菌液，使用His-TRAP?FF Crude柱进行纯化，得到纯化的JEV-E III蛋白。3.根据权利要求2所述的检测猪乙型脑炎病毒的EII1-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于:步骤(1)中所述的反转录的反应体系为:总RNA12yL、dNTPs2yL、随机引物I μ L、RRI2 μ L、AMVl μ L,加 ddH20 至总体积为 20 μ L。4.根据权利要求2所述的检测猪乙型脑炎病毒的EII1-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于:步骤(1)中所述的PCR的反应体系为:10XBuffer5yL，浓度为2mM的dNTPs5 μ L,浓度为 25mM 的 MgS044 μ L,引物 PlL 5 μ L，引物 P21.5μ L, cDNA2 μ L, KOD 酶I μ L，加 ddH20 至 50 μ L ; 步骤(1)中所述的PCR的反应条件为:94°C预变性2min ;94°C热变性15s、55°C 30s、68°C lmin，共30个循环；68°C 8min终延伸。5.根据权利要求1所述的检测猪乙型脑炎病毒的EII1-间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于: 所述的以纯化的JEV-E III蛋白作为包被抗原的酶标板，通过如下步骤制备得到:将纯化的JEV-E III蛋白用包被缓冲液稀释到4.7 μ g/mL, 100 μ L每孔加到酶标板，4°C过夜；取过夜包被好的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金顶，姚俊庸，郑仲华，邓洁汝，刘翠翠，勾红潮，裴晶晶，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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