本发明专利技术公开了一种肺癌患者血清特异性代谢产物谱及其建立方法，具体是基于肺癌患者的血清进行液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法，包括：收集健康正常体检者和肺癌患者手术前及术后7天空腹血标本，经处理后经色谱柱分离，并采用质谱检测分析后提取并对齐仪器原始数据，采用多变量数据统计软件建立数学模型对上述代谢物谱进行分析，比较正常人与肺癌患者代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。本发明专利技术方法可以全面、综合地体现肺癌患者的代谢产物的变异状况，可用于肺癌的早期诊断或为预后提供有利的技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及癌症，特别是肺癌。本专利技术还涉及代谢组学，特别是基于液相色谱质谱联用和气相色谱质谱联用分析技术的代谢组学。本专利技术为早期诊断肺癌提供了依据，并提供了肺癌患者术前及术后血清中特异性代谢物谱以及相关特异性生物标记物。并且本专利技术还提供了建立肺癌患者术前及术后血清中特异性代谢物谱以及筛选相关特异性生物标记物的方法。
技术介绍
肺癌是世界性的恶性肿瘤之一，居目前癌症死因的首位。近20年来，尽管有关肺癌的发生发展机理的研究和诊疗水平有明显进步，但其5年生存率仍只有15%左右。原因是目前肺癌的早期诊断和治疗方法远不能满足现实临床工作所需，80%肺癌患者在就诊时就处于晚期，已丧失手术机会，仅能行姑息治疗，从而导致患者生存时间的缩短；如果能实现早期诊断，肺癌患者的5年生存率可达到85%。传统的影像学和痰液脱落细胞学仍是目前筛查早期肺癌的主要手段，但存在一定漏诊和误诊，病理学检查虽然能够诊断肺癌，但会对人体造成很大创伤。因此，早期筛查已成为肺癌防治的关键，探索和建立一种简单、快速、敏感性高和特异性强的早期诊断技术等已是临床医学上的迫切需要。代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后系统生物学的另一重要研究内容，它是研究生物体系(细胞，组织或生物体)受外部刺激所产生的所有代谢产物变化的科学。与转录组学和蛋白质组学比较，代谢组学专门研究生物体系受外部刺激后所产生的所有代谢产物的变化，能够更准确地反映生物体系的状态，且位于系统生物学的最下游，是生物体系整体功能或状态最终结果的表现。代谢组学在发现潜在生物标志物和改善肺癌早期诊断方面有独特的前景，它借助先进的分析仪器和统计工具对多种疾病进行标志物检测和研究，但用代谢组学方法研究肺癌的报道相对较少。牛艳洁等应用GC/MS分析肺癌和其它肺部疾病患者的血清及尿液小分子代谢产物，发现肺癌患者血清及尿液的代谢模式都出现明显的分离趋势。An等应用LC-MS分析肺癌和正常对照人群尿液的代谢产物，Chen等运用IHNMR分析肺癌患者组织中的代谢产物，分别发现了肺癌患者尿液和组织中的差异代谢产物。在代谢组学分析的各种技术手段中，液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(LC-Q-T0F/MS)作为一种先进的分离分析技术，在众多分析方法中脱颖而出，尤其对于非靶标代谢组学分析，其强大的定性分析能力使之被公认为最好的复杂样品分析技术之一，已经被广泛应用于代谢组学的研究领域中。气相色谱质谱联用技术(GC/MS)现已被广泛的应用于复杂组分的分离和鉴定，其结合了气相色谱的高分辨率和质谱的高灵敏度，是生物样品中药物与代谢物定性定量的有效工具。GC/MS和液相色谱质谱联用技术(LC/MS)当前也被广泛的应用到代谢组学的研究中。色谱技术主要由流动相和固定相组成，样本由流动相带入色谱仪，在气相色谱技术中，流动相即为气体。当两相作相对运动时，样本不断地在两相之间进行分配，样本各组分与固定相分子间发生吸附、溶解、结合或离子交换，使样本各组分随载气在两相之间反复多次分配，由于样本各组分之间的性质不同，流动相气体携带的样本中各种不同组分在色谱过程中的样本中表现出不同的色谱行为，最终使那些分配系数只有微小差别的组分发生很大的分离效果，从而使不同组分得到完全分离。将分离后的各种组分用质谱进行检测。并对检测后得到的代谢产物进行对比分析，最后得到各组间的差异性代谢产物，利用支持向量机、人工神经网络及主成分分析等生物信息学的方法选择部分差异性代谢产物建立判别模型。
技术实现思路
针对现有肺癌诊断方法的有创伤性、漏诊和误诊等缺点，本专利技术所要解决的问题是提供一种代谢组学技术为肺癌早期诊断提供依据，该方法具有灵敏度高，特异性好，无创等优点。本专利技术采用液相色谱-四级杆-飞行时间质谱和气相色谱质谱联用技术的分析方法，具有强大的定性分析能力，对血清仅需简单处理，成本低廉，适合大规模筛查，并且同样具有良好的特异性和灵敏度，具有非常好的应用前景。本专利技术为早期诊断肺癌提供了依据。通过寻找肺癌患者术前及术后血清中特异性代谢物谱以及相关特异性生物标记物，建立检测该生物标记物的方法。本专利技术运用基于液相色谱-四级杆-飞行时间质谱联用分析和气相色谱质谱联用技术对肺癌患者和健康人血浆中的代谢物质进行定性定量分析，通过考察肺癌患者和正常人的代谢指纹图谱变化，将健康人及肺癌患者很好的区分开，并从中找出潜在的肿瘤标志物。同时检测肺癌术前和肺癌术后患者的代谢指纹图谱变化，以期通过考察患者血清中的代谢物变化，总结肺癌肿瘤复发和预后的相关代谢标志物，为今后肺癌患者的预后判别提供理论依据。本专利技术提供了一种代谢组学技术在肺癌疾病中的应用，其步骤为:(I)样本的收集与处理:收集临床病人的血清样本；样本经过甲醇沉淀蛋白。(2)液相色谱-四级杆-飞行时间质谱和气相色谱质谱测定:采用基于液相色谱质谱和气相色谱质谱联用的方法得到血清中的代谢物谱，代谢物谱经过处理得到各个峰的峰高或者峰面积以及质量数和保留时间等数据。(3)模式识别分析血清中代谢物谱:上述数据采用多变量数据统计软件Simca-Pll.0，选用主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘方分析(OPLS)等方法建立数学模型，对步骤(2)中产生的代谢物谱进行分析，比较正常人与肺癌患者手术前后代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。(4)生物标记物:发现了一组血清中的生物标记物用于肺癌疾病的诊断或者为肺癌早期诊断提供依据。随着代谢组学的发展，越来越多的研究发现，分子质量小于1000的内源性小分子代谢物更加具有早期诊断价值，作为一种新的检测工具，代谢组学方法已成为肿瘤标志物检测中的研究热点。研究表明，正常人与肺癌病人的代谢谱存在明显的差异，代谢组学技术有助于肺癌等疾病的诊断。1.检测血清中的代谢物谱和相关的生物标记物，与目前常用传统的影像学、痰液脱落细胞学及病理学检查等侵入性方法相比，具有无创，方便快捷的特点。2.准确反映肺癌患者与正常人的代谢谱差异，特异性高。不希望受任何理论的限制，专利技术人指出这些生物标志物是存在于人体中的内源性化合物。通过本专利技术所述的方法对受试者血清的代谢物谱进行分析，代谢物谱中的质量数值指示相应生物标志物的存在及在代谢物谱中的对应位置。同时，肺癌患者的所述生物标志物在其代谢物谱中表现出一定的含量范围值。【附图说明】图1.液相色谱质谱联用主成分分析得分图。菱形代表正常组，正方形代表肺癌术前组，圆形代表肺癌术后组。图2.气相色谱质谱联用主成分分析得分图。菱形代表正常组，正方形代表肺癌术前组，圆形代表肺癌术后组。图3.液相色谱质谱联用PLS-DA模型。菱形代表正常组，正方形代表肺癌术前组，圆形代表肺癌术后组。图4.气相色谱质谱联用PLS-DA模型。菱形代表正常组，正方形代表肺癌术前组，圆形代表肺癌术后组。图5.液相色谱质谱联用OPLS得分图。形代表正常组，正方形代表肺癌术前组，圆形代表肺癌术后组。图6.气相色谱质谱联用OPLS得分图。形代表正常组，正方形代表肺癌术前组，圆形代表肺癌术后组。【具体实施方式】下面结合实施例进一步描述本专利技术。I样本收集:收集健康正常体检者和肺癌患者手术前及术后7天空腹血标本各5mL于无菌促凝BD真空采血管中，2500rpm，4°C离心5mi本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于肺癌患者血清的液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法，包括：（1）样品制备：收集临床病人与正常人的血清样本，经处理去除蛋白质等大分子后准备进行色谱检测分析；（2）液相色谱质谱和气相色谱质谱分析测定：采用基于液相色谱质谱和气相色谱质谱的方法得到血清中的代谢物谱，并对代谢谱进行分析；?（3）模式识别分析血清中代谢物谱：上述数据采用多变量数据统计软件建立数学模型，对步骤(2)?中产生的代谢物谱进行分析，比较正常人与肺癌患者代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。
【技术特征摘要】
1.一种基于肺癌患者血清的液相/气相色谱质谱联用代谢组学分析方法，包括: (1)样品制备:收集临床病人与正常人的血清样本，经处理去除蛋白质等大分子后准备进行色谱检测分析； (2)液相色谱质谱和气相色谱质谱分析测定:采用基于液相色谱质谱和气相色谱质谱的方法得到血清中的代谢物谱，并对代谢谱进行分析； (3)模式识别分析血清中代谢物谱:上述数据采用多变量数据统计软件建立数学模型，对步骤(2)中产生的代谢物谱进行分析，比较正常人与肺癌患者代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。2.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中的处理包括样本经过甲醇蛋白沉淀。3.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中代谢物谱经过处理得到原始数据， 所述原始数据优选地是各个峰的峰高或者峰面积以及质量数和保留时间等数据。4.根据权利要求4所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对原始数据进行峰检测和峰匹配，优选地采用R软件平台下采用自写的程序代码进行所述峰检测和峰匹配。5.根据权利要求1所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中的多变量数据统计软件Simca-Pll.0，选用主成分分析(PCA)、偏最小二乘方判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘方分析(OPLS)等方法建立数学模型，比较正常人与肺癌患者手术前后代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。6.根据权利要求1-5中任一项所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中的样本收集具体为:收集健康正常体检者和肺癌患者手术前及术后7天空腹血标本各5 mL于无菌促凝BD真空采血管中，2500 rpm，4°C离心5 min，取上层血清，保存于-80 °C冰箱中待用。7.根据权利要求1-5中任一项所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中进行液相色谱质谱测定样本的处理为:将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100 UL的样本加入300 UL甲醇，涡漩震荡30 s,4 °C静置20 min ;所有样本进行冷冻离心(12000rpm,4 °C, 15 min)，取200 μ L上清液，转入进样小瓶备用。8.根据权利要求1-5中任一项所述的代谢组学分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中进行气相色谱质谱测定样本的处理为:将低温保存的血清样本置室温解冻摇匀，取100 UL的样本加入300 μ L甲醇，涡漩震荡30 s,4 °C静置20 min ;所有样本进行冷冻离心(12000rpm,4 °C, 15 min)，取150 μ L上清液，转入玻璃衍生小瓶，加入10 yL的内标溶液(二氯苯丙氨酸，浓度为0.02 m...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟婧，郑淑莺，戴利成，
申请(专利权)人：湖州市中心医院，
类型：发明
国别省市：
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