一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒及制备方法技术

本发明专利技术是一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒及制备方法，该方法是分别制备重组真核表达质粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁纳米磁粒，再将聚乙烯亚胺修饰的纳米磁粒与质粒p[HRE]AFP-p53按照质量比为2：1至16：1混匀，孵育30分钟，即获得p[HRE]AFP-p53/聚乙烯亚胺四氧化三铁磁性纳米粒复合物。本发明专利技术制得的复合物用于肝癌靶向基因治疗与磁流体热疗的联合，在体内外治疗试验中，均获得了具有肝癌特异性的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒及其制备方法。
技术介绍
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的恶性肿瘤,每年全世界发病率为5.5-14.9/10万人，有60-100万人死于肝细胞癌，我国是肝细胞癌发病率最闻的国家，每年发病率超过30.3/10万人。肝细胞癌侵袭性强、发病隐匿，大部分患者(80%)不能手术切除，仅能依赖化疗、放疗等治疗方法，而肝细胞癌对很多传统的化疗药物都有耐药性，且肝脏放射耐受量低，治疗效果有限。因此人们逐渐把更多的目光投向肿瘤的第四种治疗模式:生物治疗。生物治疗包括免疫治疗和基因治疗，其中基因疗法被认为有希望能从根源上治愈肿瘤，在肿瘤治疗方面显示出良好的前景。常用的治疗基因包括抑癌基因、自杀基因和反义基因。抑癌基因是与肿瘤相关性最强的基因，超过50%的人类恶性肿瘤和60%的肝细胞癌中都存在的突变，选用野生型作为治疗基因，能调节细胞周期，修复DNA，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，控制肿瘤转移，还有研究显不基因治疗可以提闻肿瘤组织对热疗、化疗和放疗的敏感性。但是目前基因治疗还不能在临床广泛开展，限制其应用的瓶颈在于其安全性问题，尤其是基因表达不可控制性所引起的正常细胞损伤，通过对基因的表达进行调控，提高基因治疗的靶向性，能最小程度的减少其治疗的毒性和副作用。 利用肿瘤细胞的特异性启动子，在转录水平实现基因表达的调控，可使治疗基因仅在靶细胞内表达，从而保护基因治疗中正常的组织和细胞不受损伤。使用AFP(alpha-fetoprotein)基因启动子能祀向AFP阳性的肝细胞癌,但J/7/7启动子较弱，介导的治疗体系很难达到理想的治疗效果，且在AFP阴性以及低AFP表达的HCC细胞中仅能介导痕量的基因表达。经研究发现，启动子的表达活性在大程度上依赖于其上游增强子的作用，若将来源于血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)基因的乏氧反应序列(及responsive作为增强子与启动子5’端融合，于乏氧诱导的条件下，在高AFP和低AFP产生的HCC细胞内都能高效的表达。由于肿瘤组织生长速度远远快于新生血管的速度，瘤体内缺乏血供，人类实体肿瘤包括肝癌中都不同程度的存在乏氧环境，而对于正常细胞，如代表肝脏恢复和储备能力的肝干细胞以及肝脏的基质细胞，即使有微弱的AFP表达，由于不存在乏氧环境，他7?及启动子介导的治疗体系对它们没有细胞毒性，可以在很大程度上保留肝脏的修复和储备能力。目前将治疗基因导入体内的运载体包括两类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体转运效率高，但是存在不够安全(如产生免疫原性、可能致宿主基因突变等)，携带基因量有限，载体功能单一等不足之处。
技术实现思路
技术问题:本专利技术提供了一种得到用于肝癌的体内外治疗，具有肝癌特异性的治疗效果的靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒的制备方法。技术方案:本专利技术的靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒的制备方法，包括下述步骤: (1)质粒p[HRE]AFP-p53的制备:将甲胎蛋白启动子序列插入质粒P⑶NA3.1的Mlu1-HindIII质粒限制性内切酶位点，得到质粒p⑶NA3.1-AFP ;将5个连续的乏氧反应序列元件插入质粒pCDNA3.1-AFP的质粒限制性内切酶MluI位点，得到质粒pCDNA3.1-HRE-AFP ;将野生型p53片段亚克隆至质粒pCDNA3.1-HRE-AFP的质粒限制性内切酶 EcoR 1-Xho I 位点，得到质粒 p[HRE]AFP-p53 ; (2)制备复合磁性纳米粒:将质粒p[HRE]AFP-p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒分别用无血清培养基稀释，然后将两者按照磁性纳米粒与P[HRE]AFP-p53质量比为2:1至16:1混和均匀，孵育后即获得靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒。 本专利技术方法的一个优选方案的步骤(2)中，磁性纳米粒与p[HRE]AFP_p53质量比为 8:1。本专利技术的靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒，是按照上述方法制备得到。有益效果:本专利技术与现有技术相比，具有以下优点: 试验证实，在本专利技术中，受到甲胎蛋白启动子介导和乏氧反应序列增强的P53蛋白仅仅局限在肝癌细胞内表达，所以对人体正常细胞和组织不会产生毒副作用，与其它的基因治疗方案相比，本专利技术的安全性和可控性极大提高。与其它靶向治疗方案相比，本专利技术不仅可以靶向原发肝细胞癌的病灶，对于原发性肝癌的转移灶也有靶向治疗作用。在本专利技术中，使用的基因载体是磁性四氧化三铁纳米粒，相比较于常用的病毒载体，纳米载体具有很有优势:其一，安全性高，可反复注射而不产生抗原性，不会导致细胞的转化。第二，携带基因数量多，对非增殖期的细胞也能有效转染，能与其他功能性材料相复合。第三。研究表明磁性纳米颗粒制备简单，生物相容性好，转染效率高，易于表面修饰，能在交变磁场中可控升温，可用于肿瘤的磁流体热疗。并且，随着纳米生物技术的发展，纳米粒子作为探针和造影剂被用于肿瘤的分子成像，可以在很大程度上提高肿瘤显像的灵敏度，对肿瘤的早期诊断具有重大的意义。因此，同时具备成像和基因转运功能的纳米粒子将能实现肿瘤的诊断和治疗相结合。此外，本专利技术可以在一个系统内实现靶向基因治疗与肿瘤磁流体热疗的结合。体内外试验数据显示，相对于单一治疗，肿瘤的磁流体热疗联合靶向基因治疗具有最大的肿瘤抑制率，取得的治疗效果要远远优于单一疗法。【附图说明】图1是肝癌靶向复合磁性纳米颗粒介导肝细胞癌选择性的细胞毒效应示意图； 图中，HepG2 (产甲胎蛋白)和SMMC7721 (不产甲胎蛋白)是肝癌细胞系。Lovo (肠癌细胞)和L929 (成纤维细胞)是非肝癌细胞系。所有的细胞系的细胞经复合磁性纳米粒转染后72小时后，计算细胞相对增值率(RPR %)。图2是体内抑瘤试验的分组效果图； 图中，每个治疗组的瘤块质量以mean 土 SD (n=5)的形式表示，*治疗组相对阴性对照组 p〈0.001。图3是体内移植瘤经热疗联合基因治疗后细胞的超微结构TEM图； 图中可见细胞中染色质聚集,边聚,典型的凋亡小体形成。【具体实施方式】下面通过实施例对本专利技术做进一步具体说明。本专利技术用于肝细胞癌的靶向基因治疗与热疗的联合治疗，在具体实施例中，不论是体外细胞试验还是体内肿瘤抑制试验的数据，都证明了该靶向肝癌的磁性纳米粒具有对肝癌组织和细胞的特异性抑制作用，同时结合磁流体热疗，具有协同治疗效果，肿瘤抑制率优于单一治疗方法。实施例1: 1.复合磁性纳米粒的制备 (I)质粒p[HRE]AFP-p53的制备:p[HRE]AFP_p53为一种重组真核表达质粒的命名，其中HRE是指代乏氧反应序列元件，在质粒表达中起到增强子的作用，AFP是指代甲胎蛋白启动子，作用是介导下游的抑癌基因P53 (—种基因的名称)仅能在肝癌细胞内表达。甲胎蛋白启动子序列通过碱基合成法制备，合成的序列两端分别含有质粒限制性内切酶MluI (MluI是内切酶的名称，以下相同)和HindIII位点，分别将真核表达质粒p⑶NA3.1(PCDNA3.1是一个常用的基因克隆质粒的名称，最早由西方生物公司合成并应用，目前尚没有对应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤：（1）质粒p[HRE]AFP?p53的制备：将甲胎蛋白启动子序列插入质粒pCDNA3.1?的MluI?HindIII质粒限制性内切酶位点，得到质粒pCDNA3.1?AFP；将5个连续的乏氧反应序列元件插入质粒pCDNA3.1?AFP的质粒限制性内切酶M1uI位点，得到质粒pCDNA3.1?HRE?AFP；将野生型p53片段亚克隆至质粒pCDNA3.1?HRE?AFP的质粒限制性内切酶EcoRⅠ?XhoⅠ位点，得到质粒p[HRE]AFP?p53；（2）制备复合磁性纳米粒：将质粒p[HRE]AFP?p53和聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒分别用无血清培养基稀释，然后将两者按照磁性纳米粒与p[HRE]AFP?p53质量比为2：1至16：1混和均匀，孵育后即获得靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒。

【技术特征摘要】
1.一种靶向治疗肝癌的复合磁性纳米粒的制备方法，其特征在于，该方法包括下述步骤: (1)质粒p[HRE]AFP-p53的制备:将甲胎蛋白启动子序列插入质粒P⑶NA3.1的Mlu1-HindIII质粒限制性内切酶位点，得到质粒p⑶NA3.1-AFP ;将5个连续的乏氧反应序列元件插入质粒pCDNA3.1-AFP的质粒限制性内切酶MluI位点，得到质粒pCDNA3.1-HRE-AFP ;将野生型p53片段亚克隆至质粒pCDNA3.1-HRE-AFP的质粒限制性内切酶 EcoR 1-Xho I 位点，得到质粒 p[HRE]A...

【专利技术属性】
技术研发人员：张东生，袁晨燕，张皓，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：