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一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO 中的表达方法技术

技术编号:9736606 阅读:176 留言:0更新日期:2014-03-06 05:19
本发明专利技术公开了一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO中的表达方法。根据人VEGF-CcDNA的序列,设计合成一对特异性引物,用RT-PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF-C基因的cDNA,回收PCR产物连接于克隆载体。本发明专利技术的有益效果是,基因测序能够证实RT-PCR产物包含VEGF-CcDNA全长。重组pcDNA3.1(-)中含有VEGF-CcDNA全长序列,Western-blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。结论:成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。

【技术实现步骤摘要】
—种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO中的表达方法
本专利技术涉及一种生化的检测方法,具体来说,一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO中的表达方法。
技术介绍
血管内皮生长因子C(VEGF -C)属VEGF/PDGF家族成员,其受体为VEGFR -2,VEGFR -3。VEGF通过VEGFR -2调节血管和淋巴管的增生,而VEGFR-3表达则局限于淋巴管内皮,VEGF -C为VEGFR-2的结合,产生生物学效应的所需浓度远高于VEGFR -C,因此,VEGFR -3是淋巴管增生特异性调节因子,用VEGF -C转基因鼠实验证实,VEGF-C的高表达可以选择性地引起淋巴管增生[2],经研究,VEGF -C表达与肿瘤淋巴管增生和转移的关系是VEGF -C高表达可促进肿瘤的淋巴转移,其机理是VEGF -C促进了肿瘤周围及间质的淋巴管生长以及肿瘤组织中淋巴管增生。为进一步研究VEGF -C在淋巴管增生中的作用及其机制,我们构建了携带人VEGF -C cDNA的基因片段的真核表达载体,研究了它在真核细胞内的表达,为探讨VEGF -C与淋巴管增生的关系,VEGF -C基因用于治疗淋巴水肿和某些癌肿的可行性提供实验依据。
技术实现思路
为克服上述技术问题,我们提出了以下技术方案: 一种检测血管内 皮生长因子C在真核细胞CHO中的表达方法,根据人VEGF -C CDNA的序列,设计合成一对特异性引物,用RT -PCR法克隆乳腺癌细胞MCF - 7VEGF -C基因的cDNA,回收PCR产物连接于克隆载体。本专利技术中,在所述步骤之后要扩增,质粒提取,酶切鉴定并进行基因序列鉴定;酶切回收VEGF -C cDNA全长的基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接称重组质粒进行酶切鉴定;采用脂质体转染法将构建的pcDNA3.1(-)/VEGF -C转染至CHO细胞中,G418加压筛选培养;最后用Western -blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF -C蛋白。本专利技术的有益效果是,基因测序能够证实RT -PCR产物包含VEGF -C cDNA全长。重组pcDNA3 ? 1(-)中含有VEGF -C cDNA全长序列,Western -blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF -C蛋白存在。结论:成功构建了人类VEGF -C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。【具体实施方式】根据人VEGF -C cDNA的序列,设计合成一对特异性引物,用RT -PCR法克隆乳腺癌细胞MCF - 7VEGF -C基因的cDNA,回收PCR产物连接于克隆载体。扩增,质粒提取,酶切鉴定并进行基因序列鉴定。酶切回收VEGF -C cDNA全长的基因片段,与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接称重组质粒进行酶切鉴定。采用脂质体转染法将构建的pcDNA3.l(-)/VEGF -C转染至CHO细胞中,G418加压筛选培养。最后用Western -blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF -C蛋白。以上所述,仅为本专利技术较佳的【具体实施方式】,但本专利技术的保护范围并不局限于此,任何熟悉本
的技术人员在本专利技术披露的技术范围内,根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网
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【技术保护点】
一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO?中的表达方法,其特征在于,根据人VEGF??C?cDNA?的序列,?设计合成一对特异性引物,?用RT??PCR?法克隆乳腺癌细胞MCF???7VEGF??C?基因的cDNA?,?回收PCR?产物连接于克隆载体。

【技术特征摘要】
1.一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO中的表达方法,其特征在于,根据人VEGF -C cDNA的序列,设计合成一对特异性引物,用RT -PCR法克隆乳腺癌细胞MCF -7VEGF -C基因的cDNA,回收PCR产物连接于克隆载体。2.如权利要求1所述的一种检测血管内皮生长因子C在真核细胞CHO中的表达方法,其特征在于,在所述步骤之后要扩增,...

【专利技术属性】
技术研发人员:王景文
申请(专利权)人:王景文
类型:发明
国别省市:

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