本发明专利技术公开了一种基于拟南芥pri-miR828基因的植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828，以及该植物表达载体的构建方法和应用，所述植物表达载体pC2300-pOT2-At-pri-miR828中含有At-pri-miR828基因以及pOT2克隆载体CaMV35s启动子，具有SEQIDNO.5所示的核苷酸序列。本发明专利技术所构建的植物表达载体转染植物后，可获得高表达At-pri-miR828基因的植株，并调控植物中花青素的生物合成。
【技术实现步骤摘要】
基于拟南芥Pr 1-mi R828基因的植物表达载体及其构建和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种拟南芥pr1-miR828基因的植物重组表达载体，以及该重组表达载体的构建及应用。
技术介绍
MicroRNA (miRNA)，也称微小RNA，是一类内源性的单链非编码小分子RNA，长度约为21-24个核苷酸。miRNA介导了一种新的基因表达调控模式，在植物体内，主要在转录后水平通过与靶mRNA的互补配对来负调控靶mRNA的转录或翻译。miRNA的表达比蛋白基因更迅速，并且不受翻译过程的影响，所以对目标基因的表达调控效率更高。作为重要的调节分子，miRNA介导的基因表达调控在植物器官的形态建成、生长发育、激素分泌、信号转导以及与环境互作等多种生理生化过程中起重要作用。MicroRNA828 (miR828)是新近测序发现的生物学功能还未全面研究的一种miRNA。在拟南芥thaliana, At)中，通过生物信息学预测和5’ RACE体外剪切实验发现，miR828 的靶基因为SiRNA 4)、PAP1/MYB75 琳 PAP2/MYB90 {PRODUCTION OF ANTHOCYANIN PIGMENT I and 2)以及 MYBl 13 (Rajagopalan etal., Genes Dev,2006,20:3407-3425 ;Luo et al., Plant Mol Biol,2012,80:117-129)。PAPl和#7377J属于MYB转录因子，在植物发育过程中参与花青素、黄酮类、苯基丙酸类等次生代谢物的合成。Zuluaga等(Funct Plant Biol, 2008, 35:606-618)发现超表达/^/^/#7沒75转录因子导致转基因番茄植株花青素合成增加。谢烨等(植物生理学报，2013年02期)的最新研究表明，miR828负调控拟南芥蔗糖诱导下花青素的生物合成。通过生物信息学方法预测，在番爺中，miR828的祀基因为乙烯不敏感基因{ethylene-1nsensitive`2,EIN2, SGN-U319128)和花青素合成相关基因 (SGN-320618)，这预示着miR828可能参与番茄花青素合成途径的调控网络。在番茄植株中，通过超表达单个异源参与类黄酮合成途径的酶基因和调苄基因，以提高果实花青素含量的方法效果欠佳。Butelli等在番茄果实中同时特异共表达由E8启动子驱动的2个转录因子，即源于金鱼草的(bHLH-type TF)和Rosl (R2R3MYB-type TF)，获得了果肉组织中花青素含量显著增加的表型(Nat Biotechnol, 2008,26:1301-1308)。但目前还未见应用miRNA调控策略提高普通番茄花青素合成积累的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种含有拟南芥pr1-miR828基因(At-pri_miR828基因)的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828，以及该植物表达载体的构建方法。本专利技术的另一专利技术目的在于提供上述构建的植物表达载体的应用。为深入解析miR828的生物学功能和建立通过遗传修饰miRNA调控番茄果实花青素含量的技术策略，本专利技术从拟南芥中分离到At-pr1-miR828基因，并构建过量表达载体。该载体的构建可以为miR828基因功能的研究和从miRNA角度研究番茄花青素生物合成积累机制提供重要的研究资料和研究基础。本专利技术提供的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828中含有At-pri_miR828基因以及P0T2克隆载体CaMV35s启动子，具有SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，其中，所述At-pr1-miR828基因连接于p0T2克隆载体CaMV35s启动子下游，p0T2-At-pri_miR828基因连接于起始表达载体PC2300的I单酶切位点处。所述At-pr1-miR828基因来源于拟南芥，含有AT4G27765.1所示的核苷酸序列(SEQ ID N0.3) ο所述起始表达载体为PCAMBIA2300，简称pC2300，由美国密歇根理工大学唐贵良教授惠赠。本专利技术还提供了一种构建上述植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的方法，是先以At-pr1-miR828基因片段连接p0T2克隆载体，得到p0T2-At-pri_miR828重组质粒；再连接线性化的PC2300表达载体和p0T2-At-pr1-miR828重组质粒，得到植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828 重组质粒。具体的，所述植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的构建方法包括如下步骤: 1)以At-pr1-miR828基因片段连接历/2dIII和&oR I双酶切的p0T2克隆载体，重组产物转化疋colimb α感受态细胞，得到p0T2-At-pr1-miR828重组质粒； 2)重组质粒p0T2-At- pr1-miR828和起始表达载体pC2300备PacI单酶切，用T4DNA连接酶连接线性化的pC2300表达载体和p0T2-At-pri_miR828质粒，酶连产物转化E.coliDm α感受态细胞，得到植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828重组质粒。本专利技术所构建的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828可以用于调控植物花青素的生物合成。其中，所述的植物包括番茄、拟南芥、小麦、水稻等。将上述构建得到的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828应用农杆菌介导法转染到番茄的子叶外植体中，获得过表达转基因植株。移栽成活后，用CTAB法提取嫩叶DNA，进行At-pr1-miR828基因的PCR扩增。对PCR鉴定结果为阳性的miR828过表达转基因植株及野生型植株分别进行则7--货及其靶基因Sly-myb-likel表达水平的荧光定量PCR分析。结果显示，转基因植株中的表达量增加，而靶基因Sly-myb-likel的表达量下降。观察转基因番茄植株与野生型植株的生长情况发现，过表达转基因番茄植株较野生型颜色发绿。提取叶片中的花青素，计算其相对含量，结果显示，-7?&货过表达转基因番茄植株的花青素含量均明显低于野生型。本专利技术构建了能够高表达At-pri_miR828基因的植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828,以本专利技术所构建的表达载体转染植物后，可获得则7?货过表达转基因植株，且该At-pr1-miR828基因能够调控植物中花青素的生物合成。本专利技术以植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828构建的则7?货过表达植株还可以用于检测何种因子对miR828的表达量和代谢途径有影响的实验研究。相对于转录因子直接参与花青素合成的调控，植物体内MicroRNA抑制靶基因表达为我们提供了一种全新的花青素合成调控机理，对完善花青素代谢途径及其调控机制具有非常重要的生物学意义。本专利技术提供了植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828在调控植物(包括番茄、拟南芥、小麦、水稻等本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于拟南芥pri?miR828基因的植物表达载体，所述植物表达载体pC2300?pOT2?At?pri?miR828中含有At?pri?miR828基因以及pOT2克隆载体CaMV35s启动子，具有SEQ?ID?NO.5所示的核苷酸序列，其中，所述At?pri?miR828基因连接于pOT2克隆载体CaMV35s启动子下游，pOT2?At?pri?miR828基因连接于起始表达载体pC2300的Pac?I单酶切位点处。
【技术特征摘要】
1.基于拟南芥pr1-miR828基因的植物表达载体，所述植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828 中含有 At-pri_miR828 基因以及 pOT2 克隆载体 CaMV35s 启动子，具有SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，其中，所述At-pr1-miR828基因连接于pOT2克隆载体CaMV35s启动子下游，pOT2-At-pri_miR828基因连接于起始表达载体pC2300的I单酶切位点处。2.权利要求1植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828的构建方法，是以At-pr1-miR828基因片段连接pOT2克隆载体，得到pOT2-At-pri_miR828重组质粒，再连接线性化的PC2300表达载体和pOT2-At-pr1-miR828重组质粒，得到植物表达载体pC2300-p0T2-At-pr1-miR828。3.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾小云，贺立恒，丁娜，刘慧，沈洁，金雷皓，李芳，唐贵良，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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