包括4041C>T突变的CYP2D6基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物学领域，涉及CYP2D6等位基因第4041位的单碱基突变，所述位点由C突变为T。具体地，本发明专利技术涉及包含该突变位点的核酸片段及其相应编码的蛋白质片段、鉴定所述突变位点的试剂、检测方法和该位点的应用，特别是鉴定该位点在指导用药中的应用。

【技术实现步骤摘要】
包括4041C > T突变的CYP2D6基因片段、所编码的蛋白质片段及其应用
本专利技术属于生物学领域，涉及CYP2D6等位基因第4041位的单碱基突变。更具体地，本专利技术涉及包含该突变位点的核酸片段及其相应编码的蛋白质片段、鉴定所述突变位点的试剂、检测方法和鉴定该位点在指导用药中的应用。
技术介绍
细胞色素P4502D6 (CYP2D6)是CYP酶家族重要的成员之一。其基因位于第22号染色体上，包括9个外显子，基因全长9432bp (GenBank注册号M33388，外显子区位于第1620-5909位)。人体内该细胞色素的量只占肝脏酶总量的2%~4%，却参与临床上20%~30%药物的代谢，这样药物包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药、镇痛药、止咳药、止吐药、抗糖尿病药及P受体阻滞药等，研究其代谢多态性具有十分重要的临床应用价值(参见参考文献I)。CYP2D6基因具有高度多态性。目前为止，NCBI SNP数据库中已经收录了超过300个突变位点。由CYP450国际命名委员命名的等位基因也已有150多个，另外还有多种新发现的突变型尚未被命名(http://www.cypalleles.k1.se/cyp2d6.htm)。每个等位基因都不同程度涉及点突变、缺失、插入、重排等，从而影响CYP2D6的活性，进而影响对药物的代谢活性，产生不同程度的药物效应。除去野生型CYP2D6*1外，目前研究较多且临床意义较大的突变型主要包括以下7种:CYP2D6*2、*3、*4、*5、*10、*17、*41，其中人种分布最广、研究最多、中国人群研究资料相对最丰富的突变型是CYP2D6*2 (2850C>T ;4180G>C)和CYP2D6*10 (1000T ；4180G>C)(参见参考文献 1、2、3)。根据目前的临床研究显示，CYP2D6基因的这种多态性是造成CYP2D6酶活性在个体之间差异显著的主要原因，携带不同CYP2D6基因型的个体间可引起药物疗效的极大差异，甚至产生严重的药物毒副作用或治疗不充分。因此，研究CYP2D6基因多态性对药物疗效的影响将对临床合理用药提供重要的科学依据(参见参考文献3、4)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供CYP2D6基因的新的单碱基突变位点，包含该突变位点的核酸片段、其编码的蛋白质片段及鉴定该突变位点在用药指导中的应用。本专利技术的第一个方面是提供核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ ID N0.1的第4041位的突变位点，且是SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第4041位的核苷酸是T ;或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID N0.2的第1318位的突变位点，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1318位的核苷酸是T ;或者所述核酸片段为上述核酸片段的反向互补序列。本专利技术的第二个方面是提供与含有对应于SEQ ID N0.1的第4041位或对应于SEQID N0.2的第1318位的突变位点的等位基因片段或其反向互补序列全部或部分杂交的等位基因特异性寡核苷酸，其中SEQ ID N0.1的第4041位或SEQ ID N0.2的第1318位的突变位点的核苷酸是T ;所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。本专利技术的第三个方面是提供用于检测和/或分析本专利技术的单碱基突变的试剂盒，所述试剂盒包含本专利技术的核酸片段或等位基因特异性寡核苷酸，或包含能够作为引物扩增所述单碱基突变但不包含该单碱基的核酸片段；所述单碱基对应于SEQ ID N0.1的第4041位或SEQ ID N0.2的第1318位。本专利技术的第四个方面是提供本专利技术的核酸片段或寡核苷酸在检测CYP2D6基因突变中的应用，其中所述核酸片段或寡核苷酸用作探针或引物；或者本专利技术的核酸片段或寡核苷酸用于制备检测CYP2D6基因突变的药物的应用；或者本专利技术的核酸片段或寡核苷酸用作检测CYP2D6基因突变的检验标志物的应用。本专利技术的第五个方面是提供一种用药指导，包括检测待测样品中CYP2D6基因的对应于SEQ ID N0.1的第4041位或SEQ ID N0.2的第1318位的单碱基突变；根据检测到的突变，调整由CYP2D6代谢的药物的给药量。[0011 ] 本专利技术的第六个方面是提供分析核酸的方法，所述方法包括分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.1的序列的核酸中对应于第4041位的核苷酸或分析待测样品中的包含对应于SEQ ID N0.2的序列的核酸中对应于第1318位的核苷酸。本专利技术的第七个方面是提供CYP2D6蛋白或其片段或变异体，所述蛋白序列为SEQID N0.3所示的序列；所述片段或变异体包含对应于SEQ ID N0.3的第440位的半胱氨酸，并且为SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。本专利技术提供了包含新的单碱基突变的CYP2D6基因和编码序列。该基因在对应于SEQ ID N0.2的第1318位核苷酸由C突变为T (1318CXT)，从而引起其编码的氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸，即对应于SEQ ID N0.3的第440位的半胱氨酸。该突变的CYP2D6蛋白(命名为R440C)对药物的代谢活性与野生型相比降低。该单碱基突变对携带此突变位点的个体的用药具有指导意义。【附图说明】图1是实施例1中的对应于本专利技术的SEQ ID N0.1序列的杂合子携带者测序图谱，其中箭头所指为CYP2D6基因第4041位核苷酸；图2是实施例2构建的双基因表达载体pIRES-Gluc-2D6的结构示意图谱；图3是实施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突变体)、CYP2D6.10(缺陷型突变体)和本专利技术的R440C蛋白针对右美沙芬及丁呋洛尔的代谢能力检测结果，其中*表示p值〈0.05 ；图4是实施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突变体)、CYP2D6.10(缺陷型突变体)和本专利技术的R440C蛋白针对右美沙芬代谢的典型LC-MS/MS检测图谱；箭头所指处分别为底物右美沙芬(右)及其代谢产物去甲基右美沙芬(左)的信号峰；其中横坐标表示保留时间，右美沙芬和去甲基右美沙芬的保留时间分别为7.5和4.8分钟，纵坐标表示信号响应值cps ；图5是实施例2中所示的CYP2D6.1(野生型)、CYP2D6.2(缺陷型突变体)、CYP2D6.10(缺陷型突变体)和本专利技术的R440C蛋白针对丁呋洛尔代谢的典型LC-MS/MS检测图谱；箭头所指处分别为底物丁呋洛尔(右)及其代谢产物I’-羟基丁呋洛尔(左)的信号峰；其中横坐标表示保留时间，丁呋洛尔和I’-羟基丁呋洛尔的保留时间分别为6.9和5.1分钟，纵坐标表不信号响应值cps。【具体实施方式】通过下述【具体实施方式】说明本专利技术，但本
技术实现思路
不限于此。如无其它说明，本专利技术的“核酸片段”由核苷酸或其类似物组成，可以是DNA、RNA或其类似物的片段；可以是单链或双链；可以是天然的(如基因组的)或合成的。本专利技术中，“突变”指在检测的基因，即CYP2D6基因中存在与野生本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQ?ID?NO.1的第4041位的突变位点，且是SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第4041位的核苷酸是T；或者所述核酸片段包含对应于SEQ?ID?NO.2的第1318位的突变位点，且是SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1318位的核苷酸是T；或者为上述核酸片段的反向互补序列。

【技术特征摘要】
1.核酸片段，所述核酸片段包含对应于SEQID N0.1的第4041位的突变位点，且是SEQID N0.1所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第4041位的核苷酸是T ;或者所述核酸片段包含对应于SEQ ID N0.2的第1318位的突变位点，且是SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸，其中第1318位的核苷酸是T ;或者为上述核酸片段的反向互补序列。2.根据权利要求1所述的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的长度是10-100、101-200,201-500或501-1000个核苷酸；优选地，所述核酸片段的长度是10_20、21_30、31-40,41-50,51-60,61-100或101-300个核苷酸；进一步优选地，所述核酸片段是SEQ IDN0.1、2或14-18所示的序列。3.等位基因特异性寡核苷酸，所述寡核苷酸与含有对应于SEQID N0.1的第4041位或对应于SEQ ID N0.2的第1318位的突变位点的等位基因片段或其反向互补序列全部或部分杂交，其中SEQ ID N0.1的第4041位或SEQ IDN0.2的第1318位的突变位点的核苷酸是T ;所述等位基因片段是SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列中的至少10个连续核苷酸或其反向互补序列。4.根据权利要求3所述的等位基因特异性寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸是探针或引物；优选地，当所述寡核苷酸是探针时，所述寡核苷酸的长度是5-100个核苷酸；当所述寡核苷酸是引物时，所述寡核苷酸的长度是15-40个核苷酸；优选地，当所述寡核苷酸是探针时，所述突变位点位于探针序列的中心或大约中心处；当所述寡核苷酸是引物时，所述突变位点位于引物的3’末端。5.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡剑平，胡国新，戴大鹏，耿培武，蔡杰，
申请(专利权)人：蔡剑平，
类型：发明
国别省市：