一种醇沉竹节参多糖及其制备方法与它的用途技术

本发明专利技术涉及一种醇沉竹节参多糖及其制备方法，该方法包括竹节参水提取、脱蛋白、氧化与醇沉等步骤。本发明专利技术使竹节参多糖具有明显的佐剂活性，其中60%醇沉竹节参多糖部分的佐剂活性最强，粘均分子量处于中间。自然界中植物多糖分布广泛，另由于其低毒性和有效性使其应用更具有优势，为开发新型疫苗佐剂找到了新的思路和方向。

【技术实现步骤摘要】
【
】本专利技术属于疫苗佐剂
。更具体地，本专利技术涉及一种醇沉竹节参多糖，还涉及所述醇沉竹节参多糖的制备方法，还涉及所述醇沉竹节参多糖的用途。【
技术介绍
】竹节参系五加科人参属植物竹节参的干燥呈竹鞭状根茎，为我国的名贵特产少常用的中药材之一。竹节参多生长在海拔1000m以上的阔叶疏林阴湿地或岩石、沟涧旁边，对土壤条件要求较高，适宜在中性或微酸性环境中生长，喜腐殖质层厚、疏松肥沃、排水良好的沙壤土。在云南、贵州、四川、湖北、陕西、甘肃、河南、浙江、安徽、江西等省民间有较长的应用历史，还有少量出口香港。有滋补强壮，散瘀止痛，止血祛痰的功效，也是土家族著名民族药，一直被湖北恩施土家族先民奉为“草药之王”。随着现代药理学研究深入，竹节参的主要功效已经逐步地体现在某一类成分，甚至到某种成分上。竹节参的主要有效成分为竹节参皂苷和多糖类。在现有技术中也记载了竹节参多糖的制备方法，例如CN101265302B以及CN101265301B记载了竹节参多糖的制备方法，但是使用该方法制备得到的竹节参多糖仅能用于简单药物和保健品之中，这些专利仅提及了竹节参多糖增强免疫力的功效，只是简单的体外增加淋巴细胞增殖活性，并未对其具体作用(疫苗佐剂)进行研究，更没有阐明用于疫苗佐剂。虽然大量研究结果显示，竹节参多糖能够明显增强机体的免疫调节功能，但是作为疫苗佐剂的研究并未见报道，而且用于疫苗佐剂的竹节参多糖在制备方法和产品的选择上具有更加严格的要求。传统的疫苗一般多为全菌或全病毒制成，含有大量的非特异免疫原性物质，既有疫苗成分，也有 佐剂作用，一般不需加佐剂。目前，用于人用疫苗的佐剂为铝盐佐剂(主要是氢氧化铝及其磷酸盐，Alum)。铝盐佐剂作为人类疫苗佐剂已使用了几十年，成为人用疫苗中常用的佐剂，具有良好的佐剂效果。随着新型疫苗的不断出现，铝盐佐剂显现出一些问题，其中包括:(I)因其理化性质特点，铝盐疫苗冷冻后胶体状态被破坏，因此不能冷冻干燥和在低温状态下运输，但现在的很多多肽疫苗必须要低温保存。(2)因含盐量高，贮存日久有结晶沉淀，使制备的疫苗稳定性得不到保障。(3)铝盐对人、畜的神经系统可能有影响。(4)在注射部位有时会发生局部无菌性脓肿，甚至可以形成肉芽肿，轻度局部反应较为常见。(5)对肿瘤疫苗不适合，以铝盐佐剂作疫苗主要适用于以抗体为保护性免疫的疫苗。(6)铝盐佐剂释放抗原物质的速度缓慢，效应也比较弱，对许多可溶性抗原都不够有效，对抗原的要求比较高。因此研究新型疫苗佐剂是制备新型疫苗的重要环节。正在开发的新型疫苗如基因工程疫苗、核酸疫苗等具有良好的抗原特异性和低毒性，但免疫原性较差，尤其需要佐剂来增强其免疫原性及宿主对抗原的保护性应答。中药活性成分多糖属于天然物质，毒副作用小，取材广泛，开发新型中药佐剂是佐剂研究发展的重要途径和新的趋势。本专利技术的竹节参多糖的制备方法把竹节参总多糖分成几个有效部位，利用黏度法区分它们的主要成分；本专利技术方法制备得到的竹节参多糖具有非常明显的免疫佐剂作用，为开发新型疫苗佐剂指明了方向。【
技术实现思路
】[要解决的技术问题]本专利技术的目的是提供一种疫苗佐剂用醇沉竹节参多糖的制备方法。本专利技术的另一个目的是提供醇沉竹节参多糖。本专利技术的另一个目的是提供所述醇沉竹节参多糖的用途。[技术方案] 本专利技术是通过下述技术方案实现的。本专利技术涉及一种用作疫苗佐剂的醇沉竹节参多糖的制备方法。该制备方法包括如下步骤:A、竹节参水提取将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:5~15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85~95%乙醇水溶液中，浸泡I~5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1:5~15，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取I~5h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取2~5次，蒸馏水提取液合并，再减压浓缩，除去其水量的4/5~14/15的水分，得到浓缩的水提取液；B、脱蛋白按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂重量比1:0.3~1.5，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液进行离心分离，离心的上清液按照上述操作重复2~10次，得到脱蛋白的上清液；C、氧化往步骤B得到的脱蛋白上清液中加入氨水，将所述合并上清液的pH值调节至7.0~9.0，再向其中缓慢滴加H2O2,在不断的搅拌下使H2O2的体积达到所述脱蛋白上清液总体积的I~5%，然后在温度30~60°C下保温2~8h，得到一种无色溶液；D、醇沉往步骤C得到的无色溶液加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为30~90%，然后在室温下静置3~15h，再进行离心，离心上清液进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。根据本专利技术的一种优选实施方式，在步骤A中，所述竹节参渣与蒸馏水按照重量比1:8~12混合，然后加热回流提取2~4h。根据本专利技术的另一种优选实施方式，在步骤A中，所述的减压浓缩是在压力0.001~0.01MPa下进行浓缩。根据本专利技术的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述浓缩水提取液与Sevage试剂的重量比是0.6~1.2。根据本专利技术的另一种优选实施方式，在步骤C中，含有H2O2的脱蛋白上清液在温度38~50°C下保温3.2~6.5h。根据本专利技术的另一种优选实施方式，在步骤D中，含有乙醇的无色溶液在室温下静置5~12h。根据本专利技术的另一种优选实施方式，在步骤D中，所述真空干燥是在压力0.01~0.1MPa与温度30~50°C的条件下进行干燥。根据本专利技术的另一种优选实施方式，所述的离心分离是在离心机转速1000~3000转/分的条件下进行分离的。本专利技术还涉及采用所述制备方法所得到的醇沉竹节参多糖。本专利技术还涉及所述的醇沉竹节参多糖在制备疫苗佐剂中的用途。下面将更详细地描述本专利技术。本专利技术涉及一种用作疫苗佐剂的醇沉竹节参多糖的制备方法。该制备方法包括 如下步骤:A、竹节参水提取将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:5~15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85~95%乙醇水溶液中，浸泡I~5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1:5~15，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取I~5h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取2~5次，蒸馏水提取液合并，再减压浓缩，除去其水量的4/5~14/15的水分，得到浓缩的水提取液；所述的竹节参原料是目前我国市场上销售的竹节参中药材，例如湖北省恩施州宣恩椿木营竹节参种植基地种植的竹节参。通常，竹节参中药材需要进行常规挑选、清洗、干燥等预处理后，再使用在中药材加工
中通常使用的粉碎机对干燥竹节参进行粉碎，粉碎的竹节参再用标准筛进行筛分，收集20-40目竹节参粉作为本专利技术方法的处理原料。根据本专利技术，用乙醇处理竹节参的作用在于去除竹节参另一主要成分皂苷及其它脂溶性杂质的干扰。在本专利技术中，使用体积分数为85~95%乙醇水溶液浸泡竹节参粉，如果乙醇水溶液的浓度超过95%，则会使脂溶性皂苷成分除不去达不到脱脂的效果；如果乙醇水溶液的浓度低于85%，则会使得多糖含量降低；因此，乙醇水溶液的浓度为85~95%是合适的，优选地是88本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用作疫苗佐剂的醇沉竹节参多糖的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：A、竹节参水提取将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：5～15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85～95%乙醇水溶液中，浸泡1～5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1：5～15，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取1～5h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取2～5次，蒸馏水提取液合并，再减压浓缩，除去其水量的4/5～14/15的水分，得到浓缩的水提取液；B、脱蛋白按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂按重量比1：0.3～1.5，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液进行离心分离，离心的上清液按照上述操作重复2～10次，得到脱蛋白的上清液；C、氧化往步骤B得到的脱蛋白上清液中加入氨水，将所述上清液的pH值调节至7.0～9.0，再向其中缓慢滴加H2O2，在不断的搅拌下使H2O2的体积达到所述脱蛋白上清液体积的1～5%，然后在温度30～60℃下保温2～8h，得到一种无色溶液；D、醇沉往步骤C得到的无色溶液中加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的乙醇浓度达到体积分数为30～90%，然后在室温下静置3～15h，再进行离心，离心上清液进行真空干燥，得到醇沉竹节参多糖。...

【技术特征摘要】
1.一种用作疫苗佐剂的醇沉竹节参多糖的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤: A、竹节参水提取 将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:5~15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为85~95%乙醇水溶液中，浸泡I~5h，再加热回流提取脱脂，分离得到提取液与竹节参渣，提取液弃去，按照竹节参渣与蒸馏水的重量比1:5~15，往所述竹节参渣中添加蒸馏水，加热回流提取I~5h，然后分离，提余的竹节参渣再用蒸馏水重复提取2~5次，蒸馏水提取液合并，再减压浓缩，除去其水量的4/5~14/15的水分，得到浓缩的水提取液； B、脱蛋白 按照步骤A得到的浓缩水提取液与Sevage试剂按重量比1:0.3~1.5，往所述浓缩水提取液中加入Sevage试剂，震摇后静置，上层液进行离心分离，离心的上清液按照上述操作重复2~10次，得到脱蛋白的上清液； C、氧化 往步骤B得到的脱蛋白上清液中加入氨水，将所述上清液的pH值调节至7.0~9.0，再向其中缓慢滴加H2O2，在不断的搅拌下使H2O2的体积达到所述脱蛋白上清液体积的I~5%，然后在温度30~60°C下保温2~8h,得到一种无色溶液； D、醇沉 往步骤C得到的无色溶液中加入体积分数为95%乙醇，使无色溶液中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁丁，张长城，刘朝奇，王婷，孙志伟，周志勇，崔倩倩，万静枝，何毓敏，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：