一种水母心血管毒素粗提物的制备方法技术

本发明专利技术涉及海洋生物技术领域，本发明专利技术的目的在于提供一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，该方法是以鲜活水母触手（非口腕或整个口腕部组织）为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母心血管毒素的方法。本发明专利技术的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少，且不含溶血毒素，有利于心血管组分的进一步纯化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及海洋生物
，具体涉及。
技术介绍
水母蜇伤已成为最常见的海洋生物伤，水母毒素是导致蜇伤后系列症状的主要原因。水母毒素具有心血管、溶血、神经、肝脏、皮肤与肌肉、蛋白酶等多重生物活性，是一类具有较高研究价值的海洋肽类毒素。心血管毒素造成的循环功能损伤是水母蜇伤致死的主要原因，但心血管毒素组分在水母毒素中丰度较低。以往的水母毒素粗提物制备方法存在耗时长、易引入非毒素成分、制备量小等不足，尤其是不能避免其他高丰度蛋白和毒素(如组织蛋白、溶血毒素)的干扰，长期以来水母毒素心血管毒性成分的纯化、鉴定及机制研究进展缓慢。水母毒素粗提物制备主要有两种方法:一种是以水母口腕部组织(触手、口腕的混合物)为原料，利用水母组织易自溶的特点，低温(4°C )下搅拌自溶3-4天，离心收集上清经透析即为毒素粗提物(Xiao L, He Q, Guo Y, et al., Cyanea capillata tentacle-onlyextract as a potential alternative of nematocyst venom:1ts cardiovasculartoxicity and tolerance to isolation and purification procedures [J].Toxicon.2009, 53 (I): 146 - 152);另一种是切取水母触手、口腕或整个口腕部组织，低温自溶3-4天后，离心收集沉淀，洗涤沉淀并收集其中的刺丝囊，再通过超声或研磨破碎刺丝囊，离心收集上清经透析为毒素粗提物样品(Marino A, Crupi R, Rizzo G, Morabito R, MusciG, La Spada G. 2007.The unusual toxicity and stability properties of crude venomfrom isolated nematocysts of Pelagia noctiluca(Cnidaria, Scyphozoa).Cell Mol Biol(Noisy-1e-grand).53Suppl:0L994-1002.)。综上所述，这两种方法均需经过组织自溶，耗时较长。前者操作相对简易，但必然引入大量非毒素类组织蛋白；后者所制毒素粗提物较前者纯净，但操作环节较多，期间刺丝囊发射率高、损耗大，所获毒素蛋白量很小。总的来说，这两种制备水母毒素粗提物的方法均存在局限性，难以满足后续毒素组分离纯化的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简便、耗时较短、杂质较少、更利于进一步纯化的水母心血管毒素粗提物的制备方法。本专利技术的主要技术方案是:以鲜活水母触手(非口腕或整个口腕部组织)为原料，利用物理刺激方法，通过短时剧烈振荡来激发刺丝囊，使得多数刺丝囊集中发射，排出囊中毒液，然后离心收集上清，粗提水母心血管毒素的方法。本专利技术提供了，包括以下步骤:A、以鲜活水母触手为原料,加入PBS (Phosphate Buffer Solution,磷酸盐缓冲液)清洗；B、振荡:加入与步骤A的触手等体积的PBS，在涡旋振荡器上以转速2000-3200rpm,最优为 3200rpm,振荡 l-5min,最优为 2min ；C、过滤:步骤B得到的内容物以100-500目，最优为300目筛网过滤，收集滤液；D、透析:步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4°C下用预冷的PBS 透析 6-24h，最优为 8h 后，4°C下 3000-10000 X g 离心 10_30min，最优为 10000 Xg 离心IOmin,收集上清液，即得水母心血管毒素粗提物。所述的步骤A中，挑选有活力、触手发达的水母个体，以尼龙丝手抄网捕捞，捕捞的鲜活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢复自然活动形态；分离不含口腕组织的触手，剪取触手组织，分装到离心管中。上述步骤中，PBS缓冲液是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Solution)。上述步骤中，预冷的PBS缓冲液中的预冷为常规技术，最优的为:使用的PBS缓冲液需经过孔径为0.20 μ m的微孔滤膜过滤，于4°C预冷。所述的步骤A中，加入与触手组织等体积的PBS，摇动离心管，将上层清洗液倾尽。本专利技术的方法操作简便、耗时较现有技术缩短2-3天，非毒素类杂质蛋白引入少，且不含溶血毒素，有利于心血管组分的进一步纯化。【附图说明】图1是本专利技术的方法与自溶法所制水母毒素粗提物SDS-PAGE电泳图；图2是本专利技术的方法与自溶法所``制水母毒素粗提物溶血活性比较。图3是本专利技术的方法与自溶法所制水母毒素粗提物心血管活性比较。【具体实施方式】现结合附图和实施例，对本专利技术作详细描述，但本专利技术的实施不仅限于此。本专利技术所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1本专利技术的方法(简称快速法)制备水母心血管毒素粗提物PBS配制:称取8g NaCl.0.2g KC1、3.63g Na2HPO4.6Η20和0.24gKH2P04，溶于900mL蒸馏水中，用盐酸调节PH值至7.4，加蒸馏水定容至1L，最后用孔径为0.20 μ m的微孔滤膜过滤，于4°C预冷。1.水母采集:发形霞水母(Cyanea capillata)采自浙江省舟山市嵊泗县。挑选活力较好且触手发达的水母个体，以手抄网捕捞。首先将捕获的水母放入盛有海水的水箱中静置IOmin,待其恢复自然活动状态。2.触手分离:剔除触手处杂质，仔细区分触手和口腕等不同组织，准确剪取触手，置于50ml离心管中，每管新鲜触手组织约20ml。3.清洗:加入20mlPBS，轻柔摆动离心管清洗触手组织，将上层清洗液轻轻倾尽。4.振荡:加入20ml PBS，于涡旋振荡器上以转速3200rpm连续振荡2min。5.过滤:管中内容物以300目筛网过滤2次，收集滤液。6.透析:将滤液置于1000Da透析袋中，4°C下用预冷PBS中透析8h后，4°C下1000OXg离心lOmin，收集上清液，即为快速法所制水母心血管毒素粗提物。实施例2现有技术的自溶法制备水母毒素粗提物 发形霞水母采自浙江省舟山市嵊泗县。取口腕部组织(触手、口腕的混合物)100g，加入等体积预冷的3.34%人工海水lOOmL，自溶4天，磁力搅拌器每日搅拌2次，每次IOmin ；100目细胞筛网过滤3次，滤液10000 X g离心3次，每次lOmin，收集上清液；将上清液置于截留分子量为1000Da的透析袋中，4°C下用预冷PBS中透析8h后，4°C下1000OXg离心IOmin,上清液即水母毒素粗提物(TE, tentacle extract)。(人工海水配制:称取NaC128g，MgCl2 ?册205g，KC10.8g，CaCl2L 033g，加蒸馏水至 1L，混匀后用孔径为 0.20 μ m 的微孔滤膜过滤，于4°C预冷。)实施例3自溶法与快速法所制水母毒素粗提物比较1、蛋白质纯度比较将快制法和自溶法所制毒素粗提物及蛋白分子量标准参照物(Marker)进行SDS-PAGE电泳，分别采用5%积层胶和12%分离胶，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：A、以鲜活水母不含口腕组织的触手为原料，加入PBS缓冲液清洗；B、振荡：加入与步骤A的触手组织等体积的PBS缓冲液，在涡旋振荡器上以转速2000?3200rpm，振荡1?5min；C、过滤：步骤B得到的内容物以100?500目筛网过滤，收集滤液；D、透析：步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4℃下，用预冷的PBS缓冲液透析6?24h后，4℃下3000?10000×g离心10?30min，收集上清液，即得水母心血管毒素粗提物。

【技术特征摘要】
1.一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: A、以鲜活水母不含口腕组织的触手为原料，加入PBS缓冲液清洗； B、振荡:加入与步骤A的触手组织等体积的PBS缓冲液，在涡旋振荡器上以转速2000_3200rpm,振荡 l_5min ； C、过滤:步骤B得到的内容物以100-500目筛网过滤，收集滤液； D、透析:步骤C得到的滤液置于截留分子量为1000Da透析袋中，4°C下，用预冷的PBS缓冲液透析6-24h后，4°C下3000-10000 X g离心10-30min，收集上清液，即得水母心血管毒素粗提物。2.根据权利要求1所述的一种水母心血管毒素粗提物的制备方法，其特征在于，所述的步骤A中，挑选有活力、触手发达的水母个体，以尼龙丝手抄网捕捞，捕捞的鲜活水母置于盛有海水的容器中，直至其恢复自然活动形态； 分离不含口腕的触手组...

【专利技术属性】
技术研发人员：张黎明，郑杰民，陆佳，阮增良，成熙，王蓓蕾，张博，刘丹，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：